Hướng dẫn sử dụng bộ kit tạo dẫn xuất acid amin AccQ Fluor

I. Giới thiệu

Bộ kit Waters AccQ Fluor (WAT052880) bao gồm 5 set hóa chất tạo dẫn xuất dùng cho Phương pháp phân tích acid amin AccQ Tag. Mỗi set bao gồm một vial của mỗi hóa chất sau:

  • Đệm borate AccQ Fluor (AccQ Fluor Borate Buffer) – Vial 1. Thêm đệm này vào mẫu để tạo môi trường pH thích hợp cho việc tạo dẫn xuất.
  • Bột hóa chất AccQ Fluor (AccQ Fluor Reagent Powder) – Vial 2A. Chất bột này là chất tạo dẫn xuất có tên 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) được đóng lọ dạng bột khô cho độ ổn định tối đa.
  • Tác nhân pha loãng AccQ Fluor (AccQ Fluor Reagent Diluent) – Vial 2B. Đây là acetonitril, dùng để hoàn nguyên lọ hóa chất 2A.

Bộ kit Waters AccQ Fluor vừa đủ cho 250 mẫu phân tích:

II. Tổng quan phương pháp AccQ Tag

Phương pháp AccQ Tag là kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột và phân tích bằng HPLC cho các acid amin:

  • Sử dụng kit hóa chất Waters AccQ Fluor (bằng sáng chế US 5,296,599 và EP 0 533 200 B1) để dẫn xuất hóa các acid amin.
  • Phân tách các dẫn xuất bằng HPLC
  • Phát hiện và định lượng bằng detector huỳnh quang.

III. Độ tinh khiết hóa chất

Kit hóa chất Waters AccQ Fluor được sản xuất tại với tiêu chuẩn ISO 9001-2006 dưới sự kiểm soát nghiêm ngặt để đảm bảo nhiễu nền thấp nhất có thể. Để duy trì sự tinh khiết này, xử lý các lọ hóa chất cẩn thận.

IV. Bảo quản

Khi chưa mở, bộ kit AccQ Fluor có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng lên tới một năm.

V. Hoàn nguyên hóa chất tạo dẫn xuất AccQ Fluor

Để hoàn nguyên hóa chất AccQ Fluor:

1. Làm nóng đế gia nhiệt lên tới 55

2. Búng nhẹ vial 2A trước khi mở để đảm bảo tất cả chất bột đều ở đáy lọ

3. Rửa micropipet bằng cách hút và xả 1 mL acetonitril từ vial 2B

Cảnh báo: Acetonitril dễ cháy và rất độc. Tham khảo MSDS trước khi sử dụng.

4. Chuyển 1,0 mL acetonitril từ vial 2B vào vial 2A

5. Vặn nhẹ nắp vial 2A và lắc vortex trong 10 giây

6. Làm nóng vial 2A trên đế gia nhiệt, thỉnh thoảng lắc cho đến khi tan hết bột. Không làm nóng quá 10 phút. Dung dịch sau khi đã hoàn nguyên xấp xỉ 10 mM AQC trong acetonitril.

Lưu ý: Bạn có thể bảo quản dung dịch sau khi đã hoàn nguyên trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần. Hóa chất này phản ứng với hơi nước trong không khí, vì vậy cần đóng chặt nắp khi không sử dụng và không làm lạnh để bảo quản.

VI. Sử dụng hóa chất AccQ Fluor

Lưu ý: Kit hóa chất AccQ Fluor không dành cho mục đích chẩn đoán invitro. Chỉ sử dụng bộ kit này cho mục đích nghiên cứu.

Sử dụng hóa chất sau khi đã hoàn nguyên để chuyển đổi mẫu và chất chuẩn sang dạng dẫn xuất huỳnh quang ổn định cao.

Phần tiếp theo mô tả quá trình cho:

  • Tạo dẫn xuất cho điểm chuẩn
  • Tạo dẫn xuất cho mẫu đã thủy phân.

Lưu ý: Sấy tất cả đồ thủy tinh ở 500 trong ít nhất 4 giờ.

VII. Tạo dẫn xuất cho điểm chuẩn

Điểm chuẩn chứa 100 pmol/µL của mỗi acid amin (trừ cystein ở 50 pmol/µL). Để tạo dẫn xuất cho điểm chuẩn:

1. Làm nóng đế gia nhiệt tới 55

2. Dùng một xy lanh sạch để chuyển 10 µL chất chuẩn vào đáy ống đựng mẫu sạch

3. Sử dụng micropipet để thêm 70 µL đệm borate (vial 1) vào ống đựng mẫu. Lắc vortex nhanh

4. Dùng micropipet với đầu tip sạch thêm 20 µL hóa chất tạo dẫn xuất đã hoàn nguyên (vial 2A) vào ống đựng mẫu. Lắc vortex ngay trong vài giây.

5. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

6. Sử dụng pipet Pasteur 9” để chuyển toàn bộ mẫu sang vial insert cho HPLC. Vặn nắp vial, dùng loại có septum bằng silicone chia rãnh sẵn

7. Làm nóng vial trên đế gia nhiệt ở 55 trong 10 phút.

Lưu ý: Gia nhiệt làm chuyển một phần nhỏ sản phẩm của Tyrosine thành dẫn xuất mono chính. Điều này xảy ra chậm hơn ở nhiệt độ phòng với nửa chu kỳ xấp xỉ 1 giờ.

Mỗi 5 µL chất chuẩn sau dẫn xuất hóa chứa 50 pmol của mỗi dẫn xuất acid amin trừ cystein ở 25 pmol.

VIII. Hoàn nguyên mẫu đã thủy phân

Trước khi tạo dẫn xuất cho mẫu đông khô, bạn phải hoàn nguyên nó. Để hoàn nguyên:

1. Chuẩn bị dung dịch HCl 20 mM bằng cách thêm 10 µL HCl đẳng phí (6N) vào 3 mL nước HPLC trong một vial HPLC sạch

2. Thêm 20 µL dung dịch HCl đẳng phí 20 mM vào mẫu

3. Lắc vortex kỹ.

IX. Tạo dẫn xuất cho mẫu

Để tạo dẫn xuất cho mẫu đã hoàn nguyên:

1. Làm nóng đế gia nhiệt đến 55

2. Thêm 60 µL đệm borate (vial 1) vào mẫu đã hoàn nguyên trong ống đựng 6 x 50 mm và lắc vortex

3. Thêm 20 µL dung dịch tạo dẫn xuất đã hoàn nguyên (vial 2A). Vortex nhanh trong vài giây.

4. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

5. Chuyển toàn bộ mẫu sang vial insert cho HPLC. Vặn nắp vial, dùng loại có septum bằng silicone chia rãnh sẵn

6. Làm nóng vial trên đế gia nhiệt ở 55 trong 10 phút.

X. Bảo quản dẫn xuất

Các dẫn xuất có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần với điều kiện vặn chặt nắp và tránh bay hơi.

XI. Đặc tính kỹ thuật

Waters sản xuất kit AccQ Fluor để phân tích chính xác acid amin và giảm nhiễu nền. Mỗi mũi tiêm 10 µL mẫu trắng (lấy từ dung dịch chứa 20 µL dung dịch tạo dẫn xuất và 80 µL đệm borate) chứa ít hơn 2 pmol mỗi acid amin (ít hơn 4 pmol với cystein).

Đảm bảo rằng tất cả đồ thủy tinh đều sạch. Để phép phân tích có độ chính xác cao, sấy tất cả ống đựng mẫu thủy tinh ở 500 trong ít nhất 4 giờ.

XII. Tài liệu kỹ thuật tham khảo

Cohen, S.A. and D.P. Michaud, (1993) “Synthesis of a Fluorescent Derivatizing Reagent, 6-Aminoquinolyl-N- Hydroxysuccinimidyl Carbamate, and its Application for the Analysis of Hydrolysale Amino Acids via High Performance Liquid Chromatography,” Anal. Biochem. 211, pp 279.287.

Cohen, S.A., De Antonis, K., and D.P. Michaud, (1993) “Compositional Protein Analysis Using 6-Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate, a Novel Derivatization Reagent,” Techniques In Protein Chemistry IV, pp 289.298, (R.H. Angeletil, Ed.) Academic Press, San Diego, CA.