Khối phổ trong chẩn đoán lâm sàng: Các ứng dụng trong xét nghiệm sinh hóa

Khối phổ (MS) là kỹ thuật có thể phát hiện các chất phân tích dựa vào tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z). Mặc dù kỹ thuật này đã được sử dụng trong nghiên cứu và chuyên ngành thí nghiệm lâm sàng trong nhiều thập kỷ, tuy nhiên, trong những năm gần đây, MS ngày càng được sử dụng nhiều trong các phòng xét nghiệm lâm sàng thông thường. MS, đặc biệt khi kết hợp với sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng, cung cấp khả năng phân tích rất cụ thể và thường nhạy với nhiều chất phân tích. Các ưu điểm khác của MS bao gồm phân tích đồng thời nhiều chất (> 100) và thường không cần dùng thuốc thử chuyên dụng. Các phân tích thường được đo bởi MS bao gồm thuốc, hormon và protein.

1. Giới thiệu

Sử dụng khối phổ trong các phòng xét nghiệm lâm sàng đang phát triển nhanh chóng. Mặc dù được coi là thiết bị quá chuyên biệt và tốn kém cho việc sử dụng thường quy nhưng khối phổ vẫn ngày càng được triển khai trong nhiều phòng xét nghiệm lâm sàng thông thường. Có được điều này là nhờ sự ra đời của các hệ thống khối phổ để bàn, không tốn kém và thân thiện với người dùng. Những ưu điểm chính của phép đo khối phổ bao gồm tăng độ đặc hiệu, phân tích đồng thời nhiều chất phân tích và thường không cần dùng thuốc thử chuyên dụng. Khối phổ là một công nghệ được ưa thích để phân tích nhiều loại thuốc trong phòng xét nghiệm và hormon. Một ứng dụng lâm sàng khác được triển khai tốt của khối phổ là sàng lọc sơ sinh các bệnh chuyển hóa và một số xét nghiệm sinh hóa di truyền. Trong những năm gần đây, các ứng dụng lâm sàng trong lĩnh vực phân tích protein và xác định mầm bệnh nhanh đã dần xuất hiện.

2. Nguyên tắc hoạt động

Khối phổ là một kỹ thuật phân tích dựa trên nguyên tắc các hạt tích điện di chuyển qua một trường điện hoặc từ có thể được phân tách bằng tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng. Một phân tích khối phổ điển hình có thể được chia thành các bước sau:

  • Chuẩn bị mẫu, có thể chỉ chuẩn bị tối thiểu đến chiết lỏng – lỏng hoặc chiết pha rắn.
  • Tiêm mẫu và phân tách (các) chất phân tích quan tâm bằng hệ thống sắc ký, nếu cần.
  • Mẫu được phun vào máy khối phổ. Mặc dù mẫu có thể được đưa trực tiếp, nhưng nó thường được thông qua hệ thống sắc ký khí hoặc lỏng (GC hoặc LC).
  • Ion hóa các phân tử chất phân tích. Sự ion hóa có thể đạt được thông qua các kỹ thuật khác nhau như tác động điện tử, hóa học, ion hóa tia điện, hóa học ở áp suất khí quyển và giải hấp laser bằng ma trận.
  • Tách các phân tử ion hóa. Việc tách các ion được thực hiện bằng bộ phân tích khối. Bộ phân tích khối được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng xét nghiệm lâm sàng là tứ cực. Trong những năm gần đây, bẫy ion và thời gian bay cũng đang được sử dụng đặc biệt để sàng lọc số lượng lớn chất phân tích.
  • Phát hiện các phân tử ion hóa.
  • Phân tích dữ liệu.

Sơ đồ của máy khối phổ với các tùy chọn khác nhau:

GC-MS

GC-MS đã được sử dụng trong các phòng xét nghiệm lâm sàng trong nhiều thập kỷ. Hệ thống GC-MS điển hình sử dụng khí heli, cổng tiêm mẫu, cột mao quản, máy khối phổ, hệ thống chân không, máy dò và hệ thống phân tích dữ liệu. Một quy trình phân tích điển hình liên quan đến chiết chất phân tích từ mẫu, làm giàu mẫu, tạo dẫn xuất nếu hợp chất đích không bay hơi hoặc không bền với nhiệt và tiêm mẫu vào GC-MS. Khi các ion bị phân mảnh, những ion được chọn được phân tích (theo dõi ion đã chọn) hoặc tất cả các mảnh được phân tích (theo dõi ion tổng) để tạo ra phổ khối. Theo dõi ion được chọn nhạy hơn so với theo dõi ion tổng, và thường được sử dụng trong phân tích định lượng. Theo dõi ion tổng rất hữu ích trong việc xác định các hợp chất chưa biết. Nó giống như một dấu ấn vì một phổ khối cụ thể sẽ được tạo ra bởi sự phân mảnh của một chất phân tích cụ thể. GC-MS thích hợp để phân tích các phân tử nhỏ dễ bay hơi, không phân cực và ổn định nhiệt.

LC-MS

Trong những năm gần đây, LC-MS, đặc biệt là LC-MS/MS, đã trở nên phổ biến và trở thành phương pháp được lựa chọn, đặc biệt là để phân tích hormone và protein. Số lượng phân tích có thể được đo bằng LC-MS/MS rộng hơn so với GC-MS. Các phân tích không bền với nhiệt và khó tạo dẫn xuất phù hợp hơn cho LC-MS. Hơn nữa, việc chuẩn bị mẫu thường ít hơn so với GC-MS. Nhược điểm của LC-MS/MS là độ lặp lại thấp hơn, bảo trì nhiều hơn và chi phí cao hơn so với GC-MS.

TOF-MS (Khối phổ thời gian bay)

Trong TOF-MS, tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion được xác định bằng cách tính thời gian cần thiết để ion di chuyển một khoảng cách cố định vào ống bay. Trong điện trường cố định, các ion nhẹ di chuyển nhanh hơn các ion nặng hơn. Ưu điểm chính của máy phân tích TOF-MS là độ phân giải khối cao và đo khối lượng chính xác. Ví dụ: ở m/z 100 và độ phân giải 2 ppm, sai số khối lượng nhỏ hơn m/z 0,0002. Điều này cung cấp đầy đủ thông tin để gán công thức phân tử ban đầu cho một hợp chất để phát hiện và xác định thêm. TOF-MS phân giải cao đang được sử dụng trong sàng lọc và định danh thuốc và chất chuyển hóa. Phương pháp ion hóa giải hấp thụ laser (MALDI) -TOF đang được sử dụng ngày càng nhiều trong việc định danh protein và vi khuẩn.

3. Ứng dụng lâm sàng

MS đang ngày càng được sử dụng trong phòng xét nghiệm lâm sàng để phân tích một loạt các chất phân tích. Các ứng dụng phổ biến nhất của MS là các lĩnh vực theo dõi thuốc điều trị, độc chất, nội tiết và rối loạn chuyển hóa bẩm sinh. Trong những năm gần đây, các ứng dụng mới nổi bao gồm nhận dạng mầm bệnh, proteomics và genomics.

Theo dõi nồng độ thuốc trong trị liệu TDM và độc chất học

Trong phòng xét nghiệm lâm sàng, xét nghiệm miễn dịch là phương pháp thường được sử dụng để theo dõi thuốc điều trị. Xét nghiệm miễn dịch cũng thường được sử dụng để sàng lọc một số thuốc quá liều. Vì các xét nghiệm miễn dịch không có sẵn cho một số loại thuốc và chúng không đặc hiệu, MS được sử dụng để phân tích các loại thuốc này và xác nhận lại kết quả mà xét nghiệm miễn dịch dương tính đối với các thuốc quá liều. Mặc dù GC-MS vẫn được sử dụng rộng rãi trong theo dõi thuốc điều trị và độc chất, LC-MS/MS đang được sử dụng ngày càng nhiều nhờ dễ chuẩn bị mẫu. Sử dụng GC-MS hoặc LC-MS/MS, 100 loại thuốc và chất độc có thể được sàng lọc trong một lần phân tích.

Nội tiết học

Mặc dù các xét nghiệm miễn dịch vẫn là cơ sở chính để xác định hormon, nhưng MS ngày càng được sử dụng. Các xét nghiệm miễn dịch có hiện tượng không đặc hiệu và không nhất quán, đặc biệt đối với hormon steroid và catecholamine và các chất chuyển hóa của chúng. Ví dụ, xét nghiệm miễn dịch hormon steroid thường đánh giá quá cao nồng độ thực và có sự khác biệt đáng kể giữa các phòng xét nghiệm. Điều này khiến cho việc theo dõi bệnh nhân trong thời gian dài gặp khó khăn do sự khác biệt kết quả ở một phòng xét nghiệm hoặc nhiều phòng xét nghiệm với nhau. Mặc dù cả GC-MS và LC-MS/MS đều được sử dụng để xác định xét nghiệm hormone, nhưng LC-MS/MS đang trở thành một kỹ thuật được ưa thích do dễ dàng chuẩn bị mẫu. Bảng 1 liệt kê các hormon thường được phân tích bằng phương pháp khối phổ.

  • Aldosterone
  • Androstenedione
  • Catecholamines
  • Coenzyme Q
  • Cortisol
  • Corticosterone
  • Cortisone
  • Deoxycortisol
  • Dehydroepiandrosterone
  • 1,25-Dihydroxyvitamin D
  • Estrone
  • Estradiol
  • 17- Hydroxyprogesterone
  • 17-Hydroxypregnenolone
  • 25-Hydroxyvitamin D
  • Insulin
  • Pancreatic polypeptide
  • Parathyroid hormone (PTH)
  • Metanephrine
  • Testosterone

 

Sàng lọc sơ sinh các rối loạn chuyển hóa

Khối phổ đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong sàng lọc và xác định rối loạn bẩm sinh của quá trình trao đổi chất. LC-MS/MS được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc sơ sinh để phát hiện nhiều rối loạn chuyển hóa bao gồm rối loạn axit amin, axit hữu cơ và chuyển hóa axit béo. GC-MS đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ và vẫn là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để phân tích axit hữu cơ trong nước tiểu. HPLC kết hợp với đo quang phổ là phương pháp chủ yếu để phân tích các axit amin. Phương pháp này rất tốn thời gian và đang được thay thế bằng LC-MS/MS. Các phân tích khác thường sử dụng để phát hiện các rối loạn chuyển hóa bao gồm acylcarnitine, axit mật, purin và pyrimidine. Bảng 2 và 3 liệt kê các rối loạn được sàng lọc bằng phép đo khối phổ ba tứ cực trong sàng lọc sơ sinh và các rối loạn chuyển hóa khác được chẩn đoán/xét nghiệm bằng phép đo khối phổ.

Các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh được sàng lọc ở trẻ sơ sinh:

Rối loạn chu trình axit amin/ure

Khiếm khuyết oxy hóa axit béo

Phenylketonuria

Maple syrup urine disease

Homocystinuria

Citrullinemia

Argininosuccinic aciduria

Tyrosinemia

Medium chain acyl-CoA dehydrogenase

Very long chain acyl-CoA dehydrogenase

Long chain 3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase

Trifunctional protein deficiency

Carnitine uptake defect

Short chain acyl-CoA dehydrogenase

Axit hữu cơ niệu

Các rối loạn khác

Isovaleric acidemia

Glutaric aciduria 1 and 2

3-Hydroxy-3-methylglutaric aciduria

Multiple carboxylase deficiency

Methylmalonic acid emia due to mutase deficiency

3-Methylcrotonyl CoA carboxylase deficiency

Methylmalonic acid emia due to cobalamin A and B defects

Propionic acidemia

3-Ketothiolase

Acylcarnitines

S-adenosylhomocysteine

S- adenosylmethionine

G-Aminobutyric acid

Bile acids synthesis

Cholesterol synthesis

Disorders of glycosylation

Glycosphingolipids

Neurotransmitters synthesis

Lysosomal disorders

Pterins

Purine and pyrimidine disorders

Succinylacetone

 

Các ứng dụng mới nổi khác

Trước đây, hầu hết các ứng dụng lâm sàng của MS là phân tích các phân tử nhỏ. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các ứng dụng của MS đang được mở rộng trong việc phân tích các phân tử lớn như protein, lipid, polysacarit và DNA. Ví dụ, khối phổ giải hấp thụ laser được hỗ trợ bằng ma trận (MALDI) hiện nay thường được sử dụng để nhận dạng vi khuẩn nhanh chóng. Xác định protein đang cho thấy nhiều hứa hẹn trong lĩnh vực phát hiện ung thư.

4. Triển khai khối phổ vào thực tiễn chẩn đoán

Trước khi đưa khối phổ vào phòng xét nghiệm, cần đánh giá cả nhu cầu chăm sóc bệnh nhân và cân nhắc tài chính. Ngoài ra, máy khối phổ cần cơ sở hạ tầng đặc biệt như cung cấp điện phù hợp, khí có độ tinh khiết cao và thông gió. Một nguồn cung cấp điện chuyên dụng và nguồn cung cấp điện liên tục (UPS) là cần thiết để bảo vệ thiết bị. Thách thức lớn khác là có được đội ngũ đã được đào tạo về khối phổ hoặc nhân viên đào tạo để triển khai công nghệ này trong các phòng xét nghiệm lâm sàng.

Việc triển khai khối phổ phụ thuộc vào nhu cầu cụ thể. Đôi khi, động lực chính cho việc áp dụng khối phổ là tiết kiệm đáng kể chi phí so với các phương pháp khác như xét nghiệm miễn dịch. Mặt khác, khối phổ cho kết quả phân tích vượt trội (ví dụ: phân tích hormon steroid hoặc xác nhận lại kết quả miễn dịch dương tính với các thuốc quá liều) hoặc phát triển các phương pháp đo khối phổ do thiếu các phương pháp khác. Cân nhắc về tính khả dụng của thiết bị và nhu cầu lựa chọn các xét nghiệm hiện tại và tương lai, việc triển khai khối phổ trong phòng xét nghiệm lâm sàng có thể là một thách thức và cần đánh giá tài chính và nhân lực cẩn thận.

Trong khi các hãng sản xuất khối phổ cung cấp các sản phẩm hiện đại chất lượng cao, việc tham khảo ý kiến ​​của các đồng nghiệp và trải nghiệm thực tế có thể giúp thu hẹp các lựa chọn nhà cung cấp. Phân tích một mẫu thử trên các nền tảng khác nhau có thể giúp hiểu rõ hơn về khả năng của các thiết bị khác nhau. Trước khi lựa chọn cuối cùng, sự sẵn có của dịch vụ hỗ trợ và thời gian phản hồi của nhà cung cấp cần được xem xét nghiêm túc. Không có gì lạ khi sử dụng mẫu phương pháp đã được công bố. Mặc dù vậy, triển khai và thẩm định nó có thể là một khoản đầu tư đáng kể.

Các xét nghiệm khối phổ được coi là các xét nghiệm có độ phức tạp cao theo CLIA và LDT của FDA. Phòng xét nghiệm có trách nhiệm phát triển phương pháp và đánh giá đặc tính hiệu suất của các xét nghiệm. Một số hướng dẫn CLSI có sẵn như một tài liệu tham khảo cho phép đo khối phổ và giúp đánh giá các thông số trong phát triển phương pháp như giới hạn phát hiện (LoD), giới hạn định lượng (LoQ), độ chính xác, độ lặp lại, phạm vi đo và khoảng tham chiếu. Chuẩn bị mẫu và sử dụng đồng vị làm chuẩn nội là sự độc đáo đối với các xét nghiệm khối phổ. Các đồng vị hoạt động rất giống với các chất phân tích nên làm giảm sự biến đổi khi chiết tách và phân tích mẫu. Sự khác biệt khối lượng giữa chất phân tích và chuẩn nội ít nhất 3 đơn vị khối lượng được ưa chuộng, mặc dù sự khác biệt ít nhất 5 được ưu tiên để loại bỏ nhiễu. Sau khi khối phổ được triển khai, các thiết bị, phương pháp và người dùng cần được hỗ trợ và nâng cấp liên tục.

Các bước chính trong việc triển khai khối phổ trong phòng xét nghiệm lâm sàng:

1. Nhu cầu lâm sàng

  • Yếu tố cân nhắc chính
  • Giảm thời gian chạy mẫu
  • Kiểm soát quá trình xử lý mẫu

2. Lựa chọn thiết bị

  • Dựa trên các xét nghiệm dự tính và ngân sách
  • Trải nghiệm thực tế và trao đổi với các đồng nghiệp và nhà cung cấp
  • Dịch vụ hỗ trợ và thời gian đáp ứng cho các yêu cầu

3. Lựa chọn xét nghiệm

  • Dựa trên loại thiết bị, chất phân tích và nhu cầu lâm sàng
  • Tìm kiếm tài liệu và trao đổi với các đồng nghiệp
  • Cân nhắc kinh nghiệm và đào tạo nhân viên phòng xét nghiệm

4. Chứng minh tài chính

  • Điều quan trọng là phải có lợi tức đầu tư (ROI) được quản lý chấp nhận
  • Lợi ích bao gồm xét nghiệm tại chỗ và giảm chi phí gửi mẫu
  • Khoản đầu tư chính là thiết bị
  • Những cân nhắc đầu tư khác nên bao gồm:
  1. Hợp đồng dịch vụ
  2. Cải tạo cơ sở hạ tầng
  3. Chi phí cho việc can thiệp vào phần mềm quản lý nếu muốn
  4. Chi phí vận hành liên tục (ví dụ: hóa chất cao cấp, khí)

5. Quy hoạch cơ sở hạ tầng

  • Không gian cho thiết bị
  • Máy sinh khí nitơ
  • Thông gió và giảm tiếng ồn
  • Sắp xếp lại không gian phòng xét nghiệm
  • Hệ thống điện chuyên dụng và UPS
  • Hỗ trợ CNTT và sao lưu dữ liệu

6. Đào tạo cán bộ và nhân sự

  • Cần thiết để triển khai thành công
  • Là một quá trình liên tục
  • Đào tạo tại chỗ với nhà cung cấp
  • Các khóa đào tạo trực tuyến
  • Hội thảo, hội nghị chuyên đề và các khóa học ngắn

7. Phát triển phương pháp và thẩm định

  • Đáp ứng các yêu cầu CLIA cho thử nghiệm phức tạp cao
  • Sử dụng hóa chất cấp cao nhất hiện có (cấp MS hoặc ít nhất là cấp HPLC)
  • Chọn chuẩn nội phù hợp
  • Thẩm định sẽ bao gồm
  1. Độ chính xác
  2. Độ lặp lại
  3. Giới hạn định lượng (LoQ)
  4. Dải đo
  5. Độ đặc hiệu và nhiễu

5. Kết luận

Tóm lại, trong những năm gần đây, khối phổ đã nổi lên như một công cụ quan trọng trong phòng xét nghiệm lâm sàng. Các ứng dụng chính hiện nay của nó là theo dõi thuốc điều trị, sàng lọc chuyển hóa và nội tiết. Các ứng dụng của nó đang gia tăng trong các lĩnh vực xác định protein, nhận dạng vi sinh vật và phát hiện dấu ấn sinh học.

Ngọc Việt - Tổng hợp