Phòng ngừa nhiễm bẩn khi sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS

Khi sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS, việc kiểm soát mức độ tinh sạch của hệ thống góp phần đảm bảo hiệu suất phân tích vẹn toàn qua thời gian.

Phòng ngừa nhiễm bẩn là quan trọng hơn cả trong việc kiểm soát. Nó dễ dàng hơn nhiều so với việc khắc phục và loại­­­­ bỏ sự cố.

Để phòng ngừa nhiễm bẩn, Waters khuyến cáo làm theo hướng dẫn sau:

1. Chọn đúng loại, chuẩn bị và xử lý dung môi đúng quy trình

Sử dụng dung môi sạch, không có hạt lơ lửng

Chọn hạng dung môi (grade) phù hợp với mục đích sử dụng

Hình 1. Các hạng dung môi khác nhau với Acetonitril

Sử dụng dung môi mới

Sử dụng dung môi mới nhất có sẵn, bảo quản dung môi phải đi cùng với phòng tránh vi sinh vật phát triển. Khi dung môi tiếp xúc với không khí, chúng dễ bị nhiễm bẩn từ các thành phần lơ lửng.

Nếu sử dụng dung môi hữu cơ, để ý hạn sử dụng và thời hạn sử dụng sau khi mở nắp theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Sử dụng nước siêu tinh khiết

Nước siêu tinh khiết là nước vô trùng, không chứa các hạt lớn hơn 0,2 micron, không chứa hợp chất ion hóa (điện trở suất > 18 MOhm.cm) và hấp thụ UV yếu ở các bước sóng quan trắc. Sử dụng nước siêu tinh khiết giúp giảm thiểu tối đa các tạp chất khi trộn với dung môi khác có thể đi vào cột.

Hình 2. Sử dụng nước siêu tinh khiết

Tránh vi sinh vật phát triển

Nước và các dung môi khác dễ bị vi sinh vật tác động, nó có thể làm peak xuất hiện khi chạy gradient hoặc nhiễu nền cao khi chạy đẳng dòng. Vi sinh vật có thể gây tắc đầu lọc, tắc cột và hỏng van một chiều (check valve) có thể dẫn đến tăng áp suất hệ thống, hỏng cột và tắt hệ thống đột ngột.

Để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong dung môi, chuẩn bị, lọc và khử khí dung môi gốc nước hàng ngày. Nếu tắt máy một thời gian dài (như cuối tuần), rửa toàn bộ hệ thống bằng nước, rồi rửa với tối thiểu 10% dung môi hữu cơ thích hợp.

Mẹo: Để tránh vi sinh vật phát triển, không bảo quản hệ thống trong nước hoặc > 90% dung môi gốc nước.

Hạn chế sử dụng phụ gia

  • Để giảm nhiễu nền, hạn chế sử dụng phụ gia nhất có thể (ví dụ acid, base, đệm muối…). Càng sử dụng nhiều phụ gia, dung môi càng có thể bị nhiễm bẩn.
  • Không thêm phụ gia vào chai dung môi gốc
  • Khi phát triển hoặc chuyển giao phương pháp, phụ gia nào không ảnh hưởng đến quá trình tách nên được loại bỏ. Ví dụ: Triethanolamine ngày nay đã không còn cần thiết để tạo peak đẹp với hầu hết những hợp chất cơ bản.
  • Sử dụng phụ gia chất lượng cao nhất có sẵn (tối thiểu phụ gia có hạng dành cho LC/MS)
  • Sử dụng phụ gia (như acid formic) có nồng độ sắt và các ion kim loại thấp. Acid acetic có thể chứa nhiều tạp loại này.
  • Để tránh đóng cặn, tránh sử dụng muối vô cơ hoặc các chất phụ gia trong quá trình rửa giải hữu cơ. Muối có thể kết tủa ở tỷ lệ hữu cơ cao trong chương trình gradient.
  • Sử dụng phụ gia dễ bay hơi khi sử dụng với đầu dò khối phổ. Phụ gia bay hơi chứa NH4+, acetat, format hoặc carbonat được khuyến cáo, tránh sử dụng phụ gia chứa ion Na+, K+ hoặc PO43-
  • Nếu hệ thống của bạn chứa các thành phần sillic hoặc thủy tinh (ví dụ hệ thống nano-ACQUITY hoặc M-Class UPLC) thì tránh sử dụng dung môi có pH > 10, vì nó hòa tan sillic. Rửa và bảo quản trong methanol hoặc tối thiểu 10% dung môi hữu cơ không có chất phụ gia và đệm.
  • Để xả sạch hệ thống sau khi sử dụng pha động có chứa phụ gia, rửa hệ thống ít nhất 5 phút (trong đó ít nhất 50 mL nước), sau đó là tối thiểu 10% dung môi hữu cơ (như acetonitril hoặc methanol).

Sử dụng dung môi có thể hòa tan

Đảm bảo tất cả các dung môi và mẫu, kể cả chất phụ gia, có thể hòa tan vào nhau. Protein (từ mô, máu hoặc mẫu huyết thanh) có thể kết tủa trong tỷ lệ dung môi hữu cơ cao (> 40%). Các protein kết tủa có thể làm tắc nghẽn kim bơm và ống, hoặc hấp thụ chất phân tích hay chất bẩn.

Đựng dung môi trong bình thủy tinh sạch có nắp

  • Đựng dung môi trong bình thủy tinh borosilicate màu hổ phách hoặc màu nâu sạch, loại 1A hoặc 3.3.
  • Những bình màu nâu không phải là borosilicate không được sử dụng để bảo quản dung dịch gốc nước.
  • Không bao giờ đựng chất lỏng trong nhựa, nó có thể chứa chất làm dẻo như phthalate và gây nhiễm bẩn.
  • Đậy bình chứa để ngăn chất bẩn từ không khí xâm nhập vào dung môi, sử dụng nắp đậy đi kèm hệ thống.
  • Không sử dụng Parafilm hoặc các màng nhựa khác để đậy các bình chứa dung môi.
  • Sử dụng bình chứa dung môi nhỏ nhất đủ cho phân tích của bạn (phụ thuộc vào tốc độ dòng chảy và thời gian chạy).
  • Không bồi thêm dung môi. Thay vào đó, loại bỏ dung môi cũ, rửa sạch các chai và các bộ lọc đầu vào dung môi với dung môi được sử dụng, và sau đó đổ đầy với dung môi mới. Cuối cùng, mồi lại hệ thống.

Hình 3. Vi khuẩn phát triển trong dung môi để lâu ngày

2. Làm sạch đồ thủy tinh trong phòng thí nghiệm đúng cách

Bất kỳ bình thủy tinh nào được sử dụng để chuẩn bị mẫu hoặc đựng dung môi phải được làm sạch kỹ trước khi sử dụng.

Quy trình làm sạch tiêu chuẩn

  • Rửa sạch đồ thủy tinh bằng dung môi hữu cơ và sau đó là nước.

Chú ý: Không tái sử dụng vial thủy tinh.

  • Không được rửa đồ thủy tinh bằng xà phòng, chất tẩy rửa hoặc máy rửa chén.

Chú ý: Luôn vệ sinh đồ thủy tinh với cùng pha động/dung môi bạn sử dụng cho sắc ký.

Quy trình làm sạch tăng cường

Nếu cần làm sạch tích cực hơn, hãy sử dụng quy trình sau:

  1. Siêu âm với 10% formic hoặc axit nitric, rồi đến nước, rồi đến methanol hoặc acetonitril, rồi đến nước.
  2. Lặp lại hai lần nữa.
  3. Cất giữ bình dùng để chuẩn bị mẫu hoặc đựng dung môi riêng biệt với các loại thủy tinh thông dụng khác.
  4. Nếu bình thủy tinh bị nhiễm vi sinh vật, hãy xử lý chúng trong nồi hấp:
  1. Tháo và thay thế tất cả đầu lọc và ống nối giữa bình dung môi và thiết bị.
  2. Làm sạch hệ thống bằng acetonitril hoặc methanol và để nó qua đêm.

3. Chuẩn bị và xử lý mẫu đúng cách

Đảm bảo mẫu không chứa hạt lơ lửng và phải cẩn thận không gây nhiễm bẩn trong quá trình chuẩn bị mẫu.

Sử dụng van lạnh hiệu quả

Sử dụng van lạnh khi cô cạn, làm khô hoặc chưng cất mẫu. Nếu không, dầu bơm chân không có thể chảy ngược và gây nhiễm bẩn.

Sử dụng vial, nắp và khay mẫu sạch

  • Chọn đúng loại vial cho ứng dụng của bạn. Vial của Waters đã được chứng nhận nhiều tiêu chuẩn về độ tinh sạch. Một số loại vial khác có thể chứa chất bẩn ảnh hưởng đến ứng dụng và hệ thống.

Hình 4. Vial Truview của Waters được chứng nhận độ tinh sạch phù hợp với ứng dụng LCMS

Chú ý: Không tái sử dụng vial

  • Đảm bảo màng nắp vial không chứa chất bẩn. Không sử dụng vial có màng giấy, màng silicone (với ứng dụng LC/MS). Nếu dùng màng một lớp, khuyến cáo sử dụng PTFE (không chứa nhựa và chất kết dính).
  • Sử dụng đĩa well-plate của Waters. Một số nhãn hiệu khác có thể gây rò rỉ chất hóa dẻo như diisooctyl phthalate.
  • Khi sử dụng tấm nhôm đậy mẫu, đảm bảo nhôm không chạm vào dung dịch (có thể gây ra phản ứng).
  • Không sử dụng tấm đậy tự chế hoặc chứa chất kết dính.
  • Không sử dụng các tấm đậy không tương thích với các dung môi để pha loãng mẫu, dung môi pha động và dung môi rửa.

4. Sử dụng phụ kiện và ống sạch

  • Sử dụng vật liệu trơ và sạch cho các phụ kiện tiếp xúc với dung môi hoặc mẫu như nút chai, vòng đệm O-ring, van một chiều và đầu lọc dung môi.
  • Nhãn trên ống dẫn có thể chứa chất gây nhiễm bẩn. Chúng không được tiếp xúc với dung môi hoặc pha động.
  • Một số loại ống dẫn (như polyvinyl chloride) chứa chất hóa dẻo hoặc các tạp chất khác.
  • Không để các bề mặt này tiếp xúc với bất cứ thứ gì có chứa chất gây nhiễm bẩn.

5. Đeo găng tay

Sử dụng loại trùm kín cả lòng bàn tay, không bột, không cao su latex, khuyến cáo sử dụng loại nitrile vô trùng của Waters khi:

  • Chạm vào các bộ phận trên hệ thống sắc ký lỏng có tiếp xúc với pha động hoặc mẫu
  • Thay thế các bộ phận cũ với các bộ phận có nhãn “Critical Clean”.

Thay găng tay nếu chúng bị ướt

Giữ găng tay khô và thay găng tay nếu chúng bị ướt. Găng tay ướt có thể gây nhiễm bẩn. Thường xuyên thay găng tay mới.

Thực hiện đúng quy trình đeo găng tay

Hình 5. Mở túi găng tay và đeo vào đúng cách

  1. Mở túi đựng găng tay đến khi nếp gấp lộ ra vừa đủ và phần bàn ngón tay vẫn ở trong túi
  2. Ướm bàn tay vào trong khi vẫn giữ nguyên nếp gấp, chỉ chạm tay trần vào mặt trái của găng tay. Lặp lại với bàn tay còn lại rồi cầm vòng cao su kéo xuống che kín cổ tay cả 2 bên.
  3. Khi mang găng tay, không chạm vào những bề mặt khác ngoài thành phần “Critical Clean” đang được xử lý.

6. Sử dụng cột sạch

Hạt lơ lửng, protein kết tủa và các chất bẩn hữu cơ khác có thể bị mắc lại ở đầu cột. Các chất này có thể tác động bất lợi đến tuổi thọ của cột, làm xuống cấp hạt nhồi, tăng áp suất ngược hệ thống và thay đổi độ chọn lọc.

Hình 6. Ảnh chụp kết tủa ở đầu cột từ các thành phần nhiễm bẩn

Cột cũng có thể hấp phụ tạp chất từ các dung môi. Sự hấp phụ này có thể xảy ra khi bạn:

  • Cân bằng cột pha đảo như C18 với dung môi thân nước tỷ lệ cao trong thời gian dài
  • Chạy cột pha đảo ở chế độ đẳng dòng với tỷ lệ dung môi hữu cơ thấp

Các chất hấp phụ có thể rửa giải thành các pic nhiễu trên sắc ký đồ. Theo thời gian, các chất bẩn được làm giàu và pic nhiễu ngày càng bị khuếch đại.

Rửa cột

Nếu rửa cột trong dung môi chứa phụ gia amoni hydroxyd, hạt nhồi silica sẽ bị hòa tan với pH > 8. Nếu dung môi của bạn có pH cao, Waters khuyến cáo sử dụng cột ổn định với môi trường kiềm như cột Acquity UPLC BEH hoặc XBridge.

Nguyên tắc rửa cột bị nhiễm bẩn là chọn dung môi hòa tan được các chất mà không ảnh hưởng đến cột. Ví dụ sau khi chạy mẫu với sắc ký pha đảo, ưu tiên rửa với tỷ lệ dung môi hữu cơ cao.

Tham khảo hướng dẫn của hãng sản xuất cột của bạn để có thông tin chi tiết.

Bảo quản cột

Loại bỏ đệm muối và chất phụ gia trước khi bảo quản. Bảo quản cột trong dung môi đi kèm khi xuất xưởng (ví dụ 100% acetonitril).

Tham khảo hướng dẫn sử dụng đi kèm cột để có thông tin chi tiết.

Sử dụng cột bảo vệ

Cột bảo vệ được lắp ở đầu cột phân tích, có thể thay thế, giúp giảm thiểu tác động của các tạp chất, hạt lơ lửng và sự tương tác hóa học xảy ra ở đầu cột chính.

Hình 7. Sử dụng cột bảo vệ VanGuard ghép nối tiếp với cột Acquity UPLC

7. Giữ sạch không khí phòng thí nghiệm

Các hợp chất có trong không khí trong phòng thí nghiệm có thể làm nhiễm bẩn hệ thống LC/MS

Siloxane thường có trong không khí trong phòng thí nghiệm. Những hợp chất này tồn tại trong chất khử mùi và mỹ phẩm, có thể gây nhiễm bẩn trong một số điều kiện nhất định như NanoFlow.

Hình 8. Phổ ESI+ cho thấy sự nhiễm bẩn siloxane

Phthalate cũng có trong không khí trong phòng thí nghiệm, nó đến từ bộ lọc điều hòa không khí và có thể làm nhiễm bẩn bất kỳ dung môi hoặc chất rắn nào tiếp xúc với không khí.

Ngọc Việt - Tổng hợp