Một trong những bộ phận quan trọng của kính hiển vi huỳnh quang là nguồn sáng. Kính hiển vi huỳnh quang đòi hỏi ánh sáng có cường độ cao, gần như đơn sắc mà một số nguồn sáng phổ biến, như đèn Halogen không thể đáp ứng được. Trong các ứng dụng kính hiển vi huỳnh quang, số lượng photon ra thị kính hoặc máy ảnh thường rất thấp. Điều này là do năng suất lượng tử của hầu hết các fluorochrom thấp (năng suất lượng tử là tỷ lệ của số lượng tử phát ra từ mẫu vật so với số lượng tử được hấp thụ). Để tạo ra cường độ ánh sáng kích thích đủ để cung cấp phát xạ có khả năng phát hiện, cần có nguồn sáng mạnh, thường là đèn thủy ngân (HBO), đèn halogen kim loại (HXP), laser và đèn LED. Trong đó laser được sử dụng chủ yếu cho kính hiển vi đồng tiêu với hệ thống khá phức tạp, còn các loại nguồn còn lại đều sử dụng phổ biến trong kính hiển vi huỳnh quang thông thường.

Hình 1: kính hiển vi huỳnh quang và các loại nguồn sáng khác nhau.

Các loại đèn phổ biến nhất là các đầu đốt thủy ngân, có công suất từ 50 W đến 200 W và các đầu đốt xenon từ 75 W đến 150 W. Đèn đốt thủy ngân trong Hình 2 bao gồm hai điện cực được niêm phong dưới áp suất cao trong một phong bì thủy tinh thạch anh cũng chứa thủy ngân. Những đèn này chứa đầy khí áp suất cao và cần được xử lý thận trọng khi rơi vỡ. Đèn hồ quang mất hiệu quả và có nhiều khả năng bị vỡ, nếu được sử dụng vượt quá tuổi thọ định mức của chúng. Tuổi thọ của loại đèn này thường đạt khoảng 200 giờ. Các đầu đốt thủy ngân không cung cấp cường độ đồng đều trên toàn phổ từ tử ngoại đến hồng ngoại. Phần lớn cường độ của đầu đốt thủy ngân được sử dụng trong vùng tử ngoại gần, với các cường độ cực đại ở mức 313, 334, 365, 406, 435, 546 và 578 nanomet. Ở các bước sóng khác của ánh sáng khả kiến, cường độ ổn định nhưng không quá sáng, nhưng vẫn có thể sử dụng để kích thích màu xanh.

Hình 2: đèn thủy ngân (HBO)

Tương tự như đèn thủy ngân, đèn halogen kim loại có một số vạch phát xạ nổi bật trong các vùng phổ tử ngoại, tím, lam, lục và vàng. Gần 90% năng lượng điện cung cấp cho đèn halogen kim loại được chuyển đổi thành bức xạ một cách hiệu quả. Phần còn lại chủ yếu bị mất thông qua hệ thống sưởi điện trở. Các vạch quang phổ trong đèn halogen kim loại (phát sinh từ sự chuyển trạng thái kích thích nguyên tố trong hơi thủy ngân) xảy ra ở 365, 405, 436, 546 và 579 nanomet, cho phép các nguồn sáng này hoạt động khá hiệu quả khi được sử dụng để tạo ảnh fluorophores được thiết kế riêng cho kích thích bằng đèn hồ quang thủy ngân. Chúng bao gồm DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; dòng 365nm), Alexa Fluor 405 (dòng 405nm), Cy3 và rhodamine (dòng 546nm) và MitoTracker Red (dòng 579nm). Mức bức xạ cao hơn cùng với sự ổn định theo thời gian vượt trội của đèn halogen kim loại, lại có thể điều chỉnh được cường độ ánh sáng làm cho các nguồn này hữu ích hơn so với đèn hồ quang thủy ngân. Tuổi thọ của đèn HXP cao hơn đèn HBO, khoảng 2,000h.

Hình 3: Bước sóng đèn halogen kim loại và đèn thủy ngân

Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều sử dụng laser, mặc dù chi phí cao, nhưng nó trở nên đặc biệt hữu ích trong kính hiển vi đồng tiêu quét laser. Kính hiển vi laser quét đồng tiêu (LSM) ngày nay đã trở thành một trong những thiết bị phổ biến nhất để chụp ảnh huỳnh quang trong nghiên cứu y sinh, bởi vì nó cho phép các nhà nghiên cứu hình ảnh có độ tương phản cao và khả năng phân chia quang học linh hoạt để nghiên cứu cấu trúc sinh học ba chiều của mẫu vật. Đối với các hệ thống LSM truyền thống, để phân tách huỳnh quang phát ra từ mặt phẳng tiêu cự mong muốn, một lỗ khẩu độ (pinhole) được đặt trong đường ánh sáng để loại bỏ tất cả các ánh sáng lệch tiêu điểm đi vào đầu dò (thường là đầu dò PMT). Nhờ đặc điểm này, hình ảnh tạo bởi kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải rất tốt, giúp nghiên cứu các cấu trúc rất nhỏ bên trong tế bào, như DNA, Protein,...

Hình 4: Hệ thống LSM900 của ZEISS với 4 nguồn laser: 405, 488, 561, 640nm.

Những năm gần đây, công nghệ đi-ốt phát sáng hiệu suất cao (LED) đã phát triển nhanh chóng với một bước đột phá lớn. Đèn LED đơn sắc cường độ cao hiện có sẵn nhiều màu sắc phù hợp với bước sóng kích thích của nhiều loại thuốc nhuộm và protein huỳnh quang thường được sử dụng. Giờ đây, đèn LED hiệu suất cao cung cấp cường độ đủ ở các bước sóng cụ thể cần thiết cho nhiều ứng dụng, kính hiển vi huỳnh quang có thể tận dụng lợi ích của đèn LED, bao gồm kích thước nhỏ gọn, tiêu thụ điện năng thấp, đầu ra nhiệt tối thiểu, chuyển đổi nhanh và thuộc tính điều chỉnh, ổn định khí thải cao và tuổi thọ cực kỳ dài.

Hình 5: Nguồn sáng LED mới từ ZEISS – Colibri 7

Colibri 7 là nguồn sáng mới từ ZEISS với tối đa bảy mô-đun LED với bước sóng từ UV tới đỏ đậm, mỗi kênh tạo ra ánh sáng đơn sắc có bước sóng khác nhau. Chọn một hoặc nhiều trong số chúng đồng thời phù hợp với thử nghiệm của bạn - việc chuyển đổi chỉ mất vài giây. Bạn có thể điều chỉnh cường độ của từng màu riêng biệt phụ thuộc vào đặc điểm và độ nhạy của mẫu. Nguồn sáng dải hẹp làm giảm kích thích chéo, tăng độ nhạy và độ phân giải cho hình ảnh của bạn. Colibri được điều khiển siêu nhanh thông qua phần mềm, làm cho nó thuận tiện và là giải pháp lý tưởng cho tất cả các ứng dụng tốc độ cao. Mỗi đèn LED có thể được bật và tắt hay điều chỉnh trong phạm vi micro giây. Đối với các ứng dụng phức tạp nói riêng, khả năng kết hợp các bước sóng linh hoạt mở ra một phạm vi sử dụng rộng rãi.

Lan Phương