Giới thiệu

Các phép phân tích sắc ký lỏng với thuốc generic thường dựa trên các phương pháp HPLC được mô tả trong dược điển Mỹ USP. Tuy nhiên những phương pháp này ít được cập nhật thường xuyên và sử dụng các công nghệ cũ, không tận dụng được lợi thế của cột hạt nhồi nhỏ (< 2 µm). Ngoài ra, do sự đa dạng của các tá dược và sử dụng chế độ dung môi đẳng dòng làm các tạp chất có thể không được rửa giải trọn vẹn, tích tụ trên cột, dẫn đến tăng áp suất ngược và tăng chi phí cột tiêu hao.

Trước tiên, chúng tôi sẽ so sánh kết quả phân tích theo phương pháp USP cho viên nén levonorgestrel và ethinyl estradiol sử dụng hai cột HPLC L7 khác nhau. Sau đó phương pháp này được chuyển sang UPLC với cột UPLC L7. Việc sử dụng cột hạt nhồi bé (< 2 µm) cho phép phân tích nhanh hơn đáng kể trong khi vẫn đáp ứng các tiêu chí phù hợp của hệ thống (system suitability) được chỉ định trong chuyên luận USP. Cuối cùng là các đề xuất để giảm áp suất ngược hệ thống, giảm tắc cột khi phân tích liên tục các mẫu viên nén trong thực tế.

Về tổng quan, so với phương pháp HPLC truyền thống, phương pháp UPLC giúp giảm thời gian chạy mẫu, giảm dung môi sử dụng và giảm lượng mẫu tiêm vào cột một cách rất đáng kể:

Hình 1. Biểu đồ so sánh lợi ích của phương pháp UPLC so với HPLC

Quy trình chuẩn bị mẫu:

Chuẩn:

Levonorgestrel 15 µg/mL và ethinyl estradiol 3 µg/mL trong pha động

Thử:

Phương pháp sắc ký

Bảng 1. Các thông số cài đặt trên các thiết bị sử dụng

Kết quả

Các mẫu được chuẩn bị theo chuyên luận viên nén levonorgestrel và ethinyl estradiol trong USP. Sau khi ly tâm lần 1 ở 4000 rpm trong 10 phút, dung dịch thu được mờ đục. Thử lọc qua màng PTFE 0,2 µm nhưng dịch lọc vẫn bị đục do tính chất siêu mịn của những hạt lơ lửng. Thay bằng ly tâm lần 2 ở tốc độ 12000 rpm trong 30 phút và thu lấy phần dịch phía trên, dung dịch thu được trong suốt và sẵn sàng để phân tích.

Phương pháp USP cho viên nén levonorgestrel và ethinyl estradiol yêu cầu sử dụng cột L7 và đề xuất cột Agilent Zorbax C8. Thử cột này trên hệ thống Alliance HPLC, với 5 lần tiêm lặp lại cả mẫu chuẩn và mẫu thử. Các mẫu cũng được chạy với cột Waters XBridge C8, cột này được chọn vì nó có tính chọn lọc tương tự cột Zorbax C8 và cấu trúc hóa học có cầu nối ethylene (BEH – Ethylene Bridged Hybrid) tương đương với cột UPLC được sử dụng (Acquity UPLC BEH C8). Sắc ký đồ khi chạy hai cột HPLC Zorbax và XBridge C8 được thể hiện trong Hình 3.

Hai kết quả có độ chọn lọc tương tự, nhưng cột XBridge C8 có tính lưu giữ thấp hơn so với Zorbax C8, nên thời gian chạy mẫu giảm đi một nửa, trong khi chỉ hy sinh một lượng nhỏ độ phân giải. Các kết quả tính phù hợp của hệ thống theo USP đều nằm trong giới hạn quy định với cả hai cột (Bảng 2).

Bảng 2. Các kết quả tính phù hợp của hệ thống khi so sánh HPLC với UPLC cho năm lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn và mẫu thử.

Ảnh hưởng của khả năng lưu giữ với thời gian khi phân tích thông lượng mẫu lớn là điều quan trọng cần xem xét khi lựa chọn cột trong kiểm nghiệm thuốc generic, ngay cả trong cùng một phân nhóm USP.

Tiếp theo, phương pháp trong chuyên luận được chuyển từ HPLC sang UPLC bằng ứng dụng Acquity UPLC Columns Calculator, cho phép chuyển đổi các thông số như tốc độ dòng, lượng mẫu tiêm, thời gian chạy mẫu từ HPLC sang UPLC.

Hình 2. Giao diện trực quan của phần mềm Acquity Columns Calculator của Waters, cho phép tính toán các thông số để chuyển đổi phương pháp phù hợp

Phương pháp được thu nhỏ từ cột HPLC XBridge C8 thành cột ACQUITY UPLC BEH C8, 1,7 µm. Cả hai cột đều có cùng cấu trúc hóa học và chỉ khác nhau về kích thước hạt.

Năm lần tiêm lặp lại của cả chuẩn và thử đều được phân tách tín hiệu rõ ràng. Các tiêu chí phù hợp hệ thống bao gồm %RSD của diện tích pic và độ phân giải USP giữa các pic ethinyl estradiol và levonorgestrel của phương pháp HPLC và UPLC thể hiện trong Bảng 2, trong đó phương pháp UPLC vượt qua tất cả các tiêu chí phù hợp của hệ thống. Thời gian chạy của phương pháp UPLC là 1,5 phút so với phương pháp HPLC 10 phút, giúp tiết kiệm khoảng 85% thời gian phân tích, 92% dung môi tiêu thụ và lượng mẫu tiêm (Hình 3).

Hình 3. Sắc ký đồ của 3 lần chạy với sự khác biệt về thời gian chạy mẫu

Với những lợi ích rõ ràng như vậy, một hệ thống UPLC mới là rất đáng cân nhắc.

Tuy nhiên, chúng ta chưa đánh giá sự ổn định của hệ thống qua thời gian. Mời các bạn đón đọc nội dung này trong phần 2 của bài viết sẽ được cập nhật trong thời gian sớm nhất.

Cập nhật phần 2 bài viết

Ngọc Việt - Tổng hợp