Cơ chế hoạt động của bẫy ion tuyến tính trong hệ thống SCIEX QTRAP

Keywords: QqQ, QTRAP, LC-MS/MS, Linear Ion Trap, khối phổ ba lần tứ cực, bẫy ion tuyến tính.

Giới thiệu: Bài viết này sẽ cung cấp cho bạn đọc một số khái niệm cơ bản liên quan tới khối phổ ba tứ cực (Triple Quad) và bẫy ion tuyến tính (Linear Ion Trap – LIT) cũng như các thông tin cơ bản hệ thống khối phổ lai QqQ/LIT với tên gọi thương mại là QTRAP. Về tác giả, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá (metabolites) và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492.

1. Giới thiệu

QTRAP là công nghệ độc quyền của SCIEX dựa trên hệ thống khối phổ 3 tứ cực. QTRAP là hệ thống khối phổ lai độc đáo tới từ Sciex duy trì ưu điểm định lượng mạnh mẽ của hệ thống ba tứ cực (QqQ) trong khi tăng cường khả năng định tính với hệ thống bẫy ion tuyến tính. Một hệ thống QTRAP có thể vận hành như một máy khối phổ ba tứ cực thông thường với cùng độ nhạy và đầy đủ các chức năng ghi tín hiệu của QqQ như: Ghi phổ theo dõi đa phản ứng (MRM); Ghi phổ ion mẹ (Precursor Ion Scan); Ghi phổ ion con (Product Ion Scan); Ghi phổ neutral/gain loss; Theo dõi ion chọn lọc ở Q1/Q3 (Selected Ion Monitoring); Quét toàn bộ dải phổ (Full scan). Điểm làm hệ thống QTRAP độc đáo nằm ở chỗ Q3 được thiết kế và có thể vận hành như một bẫy ion tuyến tính (LIT) cung cấp thêm các tính năng quét định tính mạnh mẽ để tăng cường năng suất cũng như sự linh động cho người sử dụng (Hình 1).

Hình 1. Mô tả cấu tạo của bẫy ion tuyến tính trên các hệ QTRAP của Sciex, trong đó 2 điện cực được thêm vào ở phía trước và phía sau của Q3, cho phép đóng mở để bắt giữ và quét các ion ra khỏi bẫy.

Trong hệ thống QTRAP, bộ lọc khối thứ ba (Q3) có thể hoạt động như một bẫy ion tuyến tính (LIT). Điều này cho phép phát hiện đồng thời một hợp chất với các MRM chọn lọc và xác định dựa trên việc ghi phổ MS/MS tự động. Do thiết kế của tứ cực, khi hoạt động ở chế độ quét, cả thế DC (1 chiều) và AC (xoay chiều – drive RF frequency) áp lên tứ cực sẽ được tăng dần lên với các giá trị phù hợp và cho phép lần lượt các ion có cùng giá trị m/z được đi qua và tới detector. Việc này tương đồng với khi các ion có cùng giá trị m/z đang được ghi tín hiệu, tất cả các ion khác sẽ bị mất đi do va chạm vào các cực và/hoặc vào thành thiết bị. Như vậy, ở chế độ quét toàn dải, tại bất cứ 1 thời điểm nào QqQ sẽ bỏ phí phần lớn các ion được sỉnh ra từ nguồn bởi vì chỉ các ion thuộc 1 cửa số khối nhỏ mới có khả năng di chuyển theo quỹ đạo ổn định trên suốt chiều dài của thiết bị (Hager, 2002). So với QqQ, các ion mẹ và/hoặc ion phân mảnh trong chế độ quét này rời khỏi buồng va chạm (Q2) và tiến vào LIT, sau đó các ion được bẫy trong khoảng thời gian cỡ mili-giây, quét và ghi tín hiệu lần lượt mà không gây mất thông tin (Hình 1). Việc áp dụng chế độ quét của LIT trong hệ thống QTRAP® cho phép định tính chất với tín hiệu cao hơn. Điều này giúp ghi lại phổ MS/MS đặc trưng của các ion chất quan tâm với “duty cycle” (thời gian để thiết bị hoàn thành 1 lần ghi tín hiệu) ngắn hơn chất lượng cao hơn và cho phép đối chiếu các mảnh thu được với thư viện phổ MS/MS.

2. Cơ chế hoạt động của bẫy ion tuyến tính trong các hệ SCIEX QTRAP

Hình 2. Đường di chuyển của ion trong hệ QTRAP, vị trí các thấu kính IQ3 và EXB (Exit) trong LIT.

Khi Q3 hoạt động như LIT, các ion được truyền qua Q1 áp thế AC/DC, được phân giải và tăng tốc vào một buồng va chạm chỉ áp thế RF (thế AC với tần số sóng radio) tiêu chuẩn (Q2) duy trì áp suất khoảng 5 × 10^-3 Torr N₂. Các ion phân mảnh và ion mẹ còn lại sau đó được bắt giữ trong LIT với áp suất thấp hơn (khoảng 3 × 10^-5 Torr). Việc sử dụng Q2 làm buồng va chạm thay vì để bắt giữ ion, đảm bảo rằng các ion đi vào LIT được làm mát (làm chậm lại) bằng va chạm, do đó tăng cường hiệu suất bắt giữ. LIT trên hệ QTRAP có thêm các thấu kính IQ3 và EXB lần lượt ở phía trước và sau của Q3. EXB đặt phía sau Q3 có dạng một lỗ mở được che bằng lưới (mesh-cover aperture) có đường kính 8 mm. Ngoài ra, một thấu kính lệch (deflector) có cùng đường kính đặt ở phía sau EXB (Londry & Hager, 2003). Thường thì, thấu kính lệch được vận hành ở khoảng 200 V so với thấu kính thoát để kéo các ion ra khỏi LIT về phía detector. LIT cho phép bắt giữ các ion theo 2 phương, gồm: (1) theo phương xuyên tâm của Q3 (radial trapping), (2) bắt giữ ion theo phương dọc trục của Q3 (axial trapping) (Hình 2). Quá trình hoạt động của LIT bao gồm 5 bước: (1) lấp đầy bẫy với các ion (fill trap), (2) trước khi quét, ion được làm chậm lại trong 5 ms, (3) quét nhanh các ion nhờ dùng thế xoay chiều phụ trợ (auxiliary RF) áp lên các tứ cực gây cộng hưởng các ion có m/z tương ứng và đi ra khỏi bẫy dọc trục (mass selective axial ejection), (4) làm trống bẫy bằng cách giảm thế xoay chiều trên các tứ cực của Q3, giảm thế DC trên IQ3 và EXB, (5) lặp lại bước 1.

2.1. Thiết lập điện thế trong hệ QTRAP để bắt giữ ion

Hình 3. Trường điện bắt giữ ion được tối ưu thêm bằng cách sử dụng thêm 4 điện cực phụ trợ hình chữ T bố trí như trong hình. Điện cực phụ trợ nhỏ dần về phía cuối bẫy cho phép hình thành gradient điện trường giúp tăng hiệu suất bắt giữ và tăng tốc độ quét phổ.

Các ion được di chuyển với 1 tốc độ thấp về phía khu vực “extract region” (là khu vực gần cuối LIT nơi ion sẽ nhận được năng lượng kích thích và đi ra khỏi bẫy và tới detector) của LIT ở giai đoạn làm chậm ion bằng cách sử dụng một thế được áp lên “Trap collar” (Hình 3). Trường điện bắt giữ ion còn được tối ưu nhờ sử dụng 4 điện cực phụ trợ có dạng chữ T (Hình 3). Các điện cực phụ trợ dạng chữ T này, thu nhỏ dần theo hướng từ cửa vào bẫy tới cửa ra bẫy, cho phép hình thành gradient điện trường, và do đó tăng cường khả năng bắt giữ cũng như tốc độ quét (Besa, n.d.). Một van điều khiển khí theo xung (pulsed gas valve) đặt ở gần khu vực của LIT và cho phép tăng cường áp suất bên trong LIT khi hoạt động (Hình 3) nhằm giảm thời gian cần phải kích thích để phá mảnh ion. Thêm vào đó sự kết hợp với RF cao cũng giúp tăng đáng kể hiệu suất phá mảnh MS3.

Một hàng rào thế được hình thành bằng cách nâng dần thế trên các điện cực phụ trợ ngay trước khi bắt đầu việc quét khối để hoàn tất quá trình tích luỹ ion. Hiệu quả của việc sử dụng trường điện dọc trục (axial field) cung cấp bởi các điện cực phụ trợ lên độ nhạy được thể hiện ở hình 4 (Hình 4). Thêm vào đó, dòng xoay chiều RF được áp lên EXB của LIT cũng cho phép tăng cường độ nhạy. Hai điểm mới này cho phép thu được độ phân giải tốt hơn “unit mass resolution” với các chế độ quét của LIT ở tốc độ quét rất cao.

Hình 4. Việc đặt thêm các điện phụ trợ, tăng cường độ nhạy cho các chế độ quét của QTRAP bằng cách di chuyển các ion đã bị bắt giữ vào khu vực “extraction region” trước khi bị đẩy theo trục ra khỏi bẫy. Hình bên trái, sử dụng điện cực phụ trợ để bắt giữ ion cho tín hiệu tốt nhất. Hình bên phải, 50% RF trên EXB cho tín hiệu cao nhất.

Hình 5 mô tả việc thiết lập điện thế để làm đầy, bắt giữ và quét ion của LIT (Hình 5). Đầu tiên, IQ2 và IQ3 được điều chỉnh để cho phép truyền một xung ion có độ dài biến đổi (5-1000 ms) qua buồng va chạm Q2 vào LIT (xung nạp – fill pulse). Đồng thời, thế DC áp lên EXB được giữ ở 100 V, để giữ cho ion không đi ra khỏi bẫy. Áp suất N₂ trong Q2 được duy trì ở khoảng 5 × 10E-3 Torr. Vào cuối xung nạp, thế trên IQ2 và IQ3 được tăng lên để bẫy các ion trong LIT. Các ion bị bắt giữ sau đó được làm chậm trong khoảng 5 ms. Ngay trước khi quét khối, thế DC trên EXB được giảm xuống một giá trị đẩy nhất định, thế xoay chiều (drive RF) và thế xoay chiều phụ trợ (aux. AC) được tăng lên cho m/z đã chọn để đẩy ion ra khỏi LIT. Bằng cách kết hợp giữa chuyển động hướng tâm và dọc trục của ion trong các trường rìa ở phía cuối LIT, sự kích thích hướng tâm được chuyển thành động năng dọc trục, cho phép đẩy ion phụ thuộc vào khối lượng ra khỏi bẫy. Cuối cùng, LIT được làm rỗng bằng cách giảm đồng thời thế DC áp lên IQ3 và EXB và giảm thế xoay chiều áp lên các thanh điện cực ở Q2 và Q3 (Hager, 2002).

Hình 5. Mô tả thiết lập giá trị thế trong các khoảng thời gian xác định cho các thấu kính IQ2, IQ3, EXB, và điện thế xoay chiều và điện thế xoay chiều phụ trợ áp lên các thanh tứ cực của LIT.

2.3. Đẩy ion ra khỏi LIT theo phương dọc trục có chọn lọc khối

Sau khi ion được bắt giữ trong LIT, để có thể quét, ion cần được đẩy ra khỏi LIT một cách chọn lọc để tiến vào detector. Có 2 kỹ thuật để đẩy ion ra khỏi LIT là “mass-selective radial ejection - MSRE” (đẩy ion có chọn lọc khối theo phương xuyên tâm) và “mass-selective axial ejection – MSAE” (đẩy ion có chọn lọc khối theo phương dọc trục). Trong đó, MSRE xảy ra khi thế xoay chiều áp lên các thanh cực được tăng lên cùng với sự hiện diện đầy đủ (về cường độ) của thế xoay chiều phụ trợ, từ đó hình thành thế xoay chiều phụ trợ cộng hưởng đẩy (auxililary AC resonance-ejection voltage) theo phuơng xuyên tâm và các ion sẽ đi ra khỏi LIT qua các không gian trống giữa các thanh tứ cực (Londry & Hager, 2003). Khác với MSRE, MSAE xảy ra khi có sự hiện diện của trường tứ cực phụ. Kỹ thuật đẩy ion khỏi bẫy này liên quan đến việc áp một trường điện xoay chiều phụ trợ với biên độ và tần số phù hợp vào bốn thanh cực của LIT, đảm bảo tần số xoay chiều phụ trợ phù hợp với dao động tần số thấp của ion trong bẫy (secular frequency) để gây ra hiện tượng cộng hưởng. Độ chính xác cơ học cao trong việc chế tạo các thanh tứ cực là rất quan trọng để duy trì chất lượng của trường điện xoay chiều trên toàn bộ chiều dài của LIT (chiều dài của LIT càng lớn, thì càng khó để duy trì độ chính xác cao khi chế tạo), và đảm bảo các ion được kích thích theo phương hướng tâm đến biên độ phù hợp một cách chọn lọc (theo khối lượng) trước khi chúng di chuyển tới “fringing filed” (trường rìa) ở phía cuối của LIT. Cần đảm bảo các ion được đẩy khỏi bẫy theo phương dọc trục phải được cô lập nhiều nhất có thể khỏi phía cuối của LIT nhằm hạn chế ảnh của hiệu ứng trường rìa. Trường rìa là hiện tượng xảy ra khi các đường sức điện trường hoặc từ trường bị bẻ cong hoặc biến đổi tại các mép/rìa của vùng điện trường/từ trường chính, thường xảy ra tại các đầu của điện cực trong bẫy ion hoặc các thiết bị tương tự. Các trường rìa xuất hiện ở 2 đầu của tứ cực, sẽ thường xuyên gây ảnh hưởng không tốt tới hoạt động của tứ cực và tới MSRE. Tại trường rìa, sự suy giảm của trường (điện) tứ cực, sự gia tăng đáng kể của trường bậc cao liên quan tới sự mở rộng đa cực của điện thế và việc kết hợp giữa trường xuyên tâm và trường dọc trục dẫn tới sự thay đổi đáng kể của thế dao động tần số thấp của ion bị bắt giữ, và do đó gây khó khăn cho việc xác định toạ độ ổn định để đẩy ion khỏi LIT (Hager, 2002). Hiệu ứng kết hợp trong các trường rìa chuyển đổi kích thích hướng tâm này thành động năng hướng trục. Các ion bị bắt giữ trong LIT được kích thích xuyên tâm thông qua một quá trình kích thích cộng hưởng và tại trường rìa ở lối ra của LIT, sự kích thích xuyên tâm này dẫn đến năng lượng động học bổ sung theo hướng dọc trục có thể vượt qua rào cản DC tại lối ra.

3. Tăng cường tín hiệu và độ phân giải khối với LIT

Hình 6. Độ phân giải khối của ion mẹ của reserpine ~ 6000 (tương đương FWHM ~ 0,1 Da) khi sử dụng tốc độ quét khôi 100 Da/giây và tần số AC phụ trợ 816 kHz với LIT.

Việc sử dụng bẫy ion tuyến tính cũng cho phép tuỳ chỉnh độ phân giải khối của thiết bị bằng cách thay đổi tốc độ quét ion ra khỏi bẫy sau khi bắt giữ. Ví dụ, phổ MS/MS của reserpine (100 pg/mL) ghi ở tốc độ quét khối 5200 Da/giây, có giá trị FWHM (độ rộng píc ở một nửa chiều cao cực đại) từ ~0,35 Da ở m/z 174 đến ~0,50 Da ở m/z 609. Khi giảm tốc độ quét xuống 1000 Da/giây, gía trị FWHM của píc dao động từ ~0,25 Da ở m/z 195 đến ~0,35 Da ở m/z 609. Độ phân giải khối cao hơn có thể đạt được bằng cách sử dụng tốc độ quét chậm hơn nữa. Hình 6 thể hiện phổ của ion reserpine m/z 609 ở tốc độ quét 100 Da/giây (Hình 6). Độ phân giải khối cho đồng vị chính (m/z 609) là ~6000 tương đượng với FWHM ~ 0,1 Da.

Hình 7. Phổ MS/MS của reserpine (100 pg/mL) đo bằng: (a) sử dụng bẫy ion tuyến tính với thời gian làm đầy bẫy là 50 mili-giây, và (b) sử dụng như QqQ thông thường. Trong mỗi trường hợp, Q1 được vận hành ở cùng độ phân giải “unit mass resolution”. Các khoảng thời gian thu nhận dữ liệu cho hai phổ đều giống nhau.

Hình 8. Phổ MS/MS của reserpine (100 pg/mL) trong khoảng m/z 250 – 330 đo bằng: (a) sử dụng bẫy ion tuyến tính với thời gian làm đầy bẫy là 50 mili-giây, và (b) sử dụng như QqQ thông thường. Trong mỗi trường hợp, Q1 được vận hành ở cùng độ phân giải “unit mass resolution”. Các khoảng thời gian thu nhận dữ liệu cho hai phổ đều giống nhau

Hình 7 hiển thị phổ MS/MS của cùng một dung dịch reserpine thu được giữa QTRAP và QqQ (Hình 7). Phổ MS/MS và cường độ tương đối của ion phân mảnh giữa hai phổ rất giống nhau do quá trình phá mảnh CID là giống nhau Tuy nhiên, cường độ ion phân mảnh ghi được khi sử dụng bẫy ion tuyến tính cho tín hiệu ≥ 16 lần so với khi sử dụng QqQ tiêu chuẩn. Độ phân giải khối và tỷ lệ tín hiệu/nhiễu thu được từ bẫy ion tuyến tính cũng vượt trội hơn so với QqQ (Hình 8).

4. Kết luận

LIT cho phép tăng cường độ nhạy của của các hệ thống như QTRAP 4500, 5500, 6500 và 6500+ lên hơn 100 lần. Trong đó, ion được bắt giữ theo phương xuyên tâm sử dụng trường điện tứ cực tần số RF và theo phương dọc trục bởi các thế DC tĩnh ở phía cuối của thanh tứ cực (khác với 3D ion trap, ion bị bắt giữ bởi trường điện tứ cực 3 chiều với tần số RF). Kết hợp với kĩ thuật đẩy ion dọc trục có chọn lọc khối, LIT cho phép tăng cường độ phân giải khối khi quét toàn dải phổ ở tốc độ thấp (chế độ ghi phổ tăng cường độ phân giải – Enhanced Resolution), cũng như ghi được phổ MS/MS của chất quan tâm với chất lượng cao với nhiều thông tin về phân mảnh cùng tín hiệu tốt (chế độ ghi phổ MS/MS tăng cường – EPI).

5. Tài liệu tham khảo

Besa, A. (n.d.). New Strategy for Easy, Sensitive and Selective Detection of THC Carboxylic Acid Direct from Hair Use of LC-MRM 3 on SCIEX QTRAP ® 5500 LC-MS/MS System.

Hager, J. W. (2002). A new linear ion trap mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 16(6), 512–526. https://doi.org/10.1002/rcm.607

Londry, F. A., & Hager, J. W. (2003). Mass selective axial ion ejection from a linear quadrupole ion trap. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 14(10), 1130–1147. https://doi.org/10.1016/S1044-0305(03)00446-X

Thăng Long Instruments © 2024. Mọi quyền được bảo lưu. Vui lòng ghi rõ nguồn khi sao chép.