Đang tải...
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm vi khuẩn được phát triển vào năm 1884 bởi nhà vi khuẩn học người Đan Mạch Hans Christian Gram. Điểm đặc biệt của kỹ thuật này là phương pháp nhuộm này giúp phân biệt được vi khuẩn gram dương và gram âm. Quá trình này giúp xác định được các loại vi khuẩn khác nhau và hình dung được hình thái của chúng bằng kính hiển vi quang học. Nhuộm Gram là một phần quan trọng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, vì vi khuẩn gram dương và gram âm thường được điều trị bằng các loại kháng sinh khác nhau .
1. Vi khuẩn
Phân tích vi sinh bằng kính hiển vi quang học là một phần không thể thiếu trong công việc tại phòng xét nghiệm y khoa. Mục tiêu là tìm kiếm và phát hiện sự hiện diện của các tác nhân gây nhiễm trùng trong mẫu bệnh phẩm. Các tác nhân gây nhiễm trùng bao gồm nấm, vi rút, vi khuẩn và kí sinh trùng. Một số loại vi khuẩn có thể gây ra các bệnh nghiêm trọng như bệnh dịch hạch và bệnh tả. Do đó, việc phát hiện chúng là rất quan trọng để xác định được liệu pháp nên khuyến nghị cho bệnh nhân.
Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có kích thước trung bình từ 0.5-10 um. Dựa vào hình thái của chúng có thể phát hiện bằng kính hiển vi. Vi khuẩn tồn tại ở nhiều hình dạng, bao gồm hình que, hình cầu (cầu khuẩn), sợi và hình xoắn (xoắn khuẩn) (Hình 1).
Hình 1: Hình dạng của vi khuẩn
Mặc dù vi khuẩn có một vùng giống như nhân chứa bộ gen (gọi là nucleoid), chúng không có nhân thực sự (prokaryote) và thường không có bào quan. Nhiễm sắc thể của vi khuẩn bao gồm các phân tử DNA tròn lớn nhất của vi khuẩn và trôi nổi tự do trong tế bào chất của tế bào. Tế bào chất cũng chứa các phân tử DNA nhỏ hơn nữa, gọi là plasmid, thường có dạng vòng và sợi đôi. Tuy nhiên, plasmid tách biệt với nhiễm sắc thể, và có thể lây truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Ribosome là cần thiết cho quá trình dịch mã trong quá trình tổng hợp protein. Tế bào chất được bao quanh bởi màng tế bào (còn được gọi là màng sinh chất) có chức năng kiểm soát sự di chuyển của các chất giữa bên trong và bên ngoài tế bào. Bên ngoài màng tế bào là thành tế bào, có chức năng đảm bảo tế bào giữ nguyên hình dạng. Thành tế bào cũng bảo vệ tế bào khỏi áp suất trương nước do nồng độ khác nhau bên trong và bên ngoài gây ra. Thành tế bào được bao quanh bởi một lớp chất nhầy bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô. Nhiều pili (phần phụ của tế bào) được tìm thấy ở bên ngoài tế bào. Chúng có thể gắn vào các chất rắn, chất dinh dưỡng từ môi trường hoặc các vi khuẩn khác Một số chủng vi khuẩn cũng chứa một roi. Vai trò chính của roi là di chuyển (Hình 2).
Hình 2: Cấu trúc của tế bào vi khuẩn
Vi khuẩn sinh sản thông qua phân chia tế bào. Một tế bào đầu tiên nhân đôi các bào quan của nó, và sau đó chia đôi. Điều này tạo ra hai tế bào giống hệt nhau với cùng một bộ gen.
2. Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp được nhà vi khuẩn học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938) phát triển để phân biệt giữa các vi khuẩn cho mục đích phân tích bằng kính hiển vi. Phương pháp nhuộm này dựa trên sự khác biệt về thành phần của thành tế bào vi khuẩn, điều mà chưa được biết vào thời điểm đó, vì màu sắc thu được của vi khuẩn dựa trên các đặc tính hóa học và vật lý của nó. Phương pháp này phân loại vi khuẩn thành hai nhóm: gram dương và gram âm. Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng vi khuẩn đều có thể được phân loại bằng phương pháp này. Do đó, các chủng gram biến đổi và gram không xác định cũng tồn tại.9
Hầu hết các chủng vi khuẩn sử dụng một đại phân tử (peptidoglycan) trong cấu trúc thành tế bào của chúng để bao bọc tế bào và tạo cho nó độ bền cấu trúc. Phân tử này được gọi là murein. Murein cực kỳ ổn định và quyết định hình thái của hầu hết các vi khuẩn do mức độ xuất hiện khác nhau của nó. Hai loại vi khuẩn chính có thể được phân biệt với nhau dựa trên độ dày của lớp murein. Vi khuẩn gram dương có thành tế bào dày, chủ yếu bao gồm một lớp murein dày từ 15 đến 80 nm với tối đa 40 lớp riêng lẻ. Ngược lại, vi khuẩn gram âm chỉ có một lớp murein dày từ 10 đến 20 nm, bao gồm một hoặc một vài lớp. Hơn nữa, chúng có một màng ngoài thứ hai bao gồm lipid, tương tự như màng tế bào ở bên ngoài thành tế bào (Hình 3).
Hình 3: Vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm
3. Quy trình Nhuộm Gram (Hình 4)
Vi khuẩn cần nhuộm được cố định trên lam kính và làm khô, sau đó thuốc nhuộm tím kết tinh được nhuộm trong khoảng thời gian từ hai đến ba phút. Tím kết tinh là một loại thuốc nhuộm anilin tích điện dương. Sau đó, mẫu vật được rửa nhanh bằng nước cất và sau đó được xử lý bằng dung dịch Lugol's iodine (phức hợp kali iodua-iodine trong nước). Điều này dẫn đến sự hình thành một phức hợp tím tinh thể-iodine trong các lớp murein. Sau đó, mẫu vật được rửa lại bằng nước cất. Phức hợp thuốc nhuộm không tan trong nước. Sự phân biệt thực tế diễn ra trong bước tiếp theo. Để làm điều này, mẫu vật được rửa bằng dung dịch phân biệt (cồn 96%) cho đến khi không còn thuốc nhuộm nào được giải phóng. Sự phân biệt này không làm cho vi khuẩn gram dương bị mất màu mạnh, vì phức hợp tím tinh thể-iodine tạo thành một liên kết cực kỳ bền vững trong các lớp murein và cồn không thể xuyên qua thành tế bào dày của vi khuẩn gram dương. Ngược lại, vi khuẩn gram âm có thể dễ dàng bị mất màu bằng cồn. Sau đó, vi khuẩn gram âm được đánh dấu bằng cách nhuộm màu tương phản sau đó trong một phút bằng safranin, làm cho nó chuyển sang màu đỏ hoặc đỏ cam (Hình 5 và hình 6).
Hình 4: Nhuộm gram của vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương
Khi thực hiện đúng, nhuộm gram là một phương pháp rất hữu ích và nhanh chóng để phân biệt giữa các loại vi khuẩn khác nhau. Thực hiện đúng phương pháp bao gồm, ngoài những thứ khác, chỉ khử hoàn toàn màu của vi khuẩn gram âm trong quá trình phân biệt. Điều này có thể đạt được bằng cách thực hiện bước phân biệt trong khoảng thời gian tối ưu. Nếu bước phân biệt không được thực hiện đủ lâu, vi khuẩn gram âm cũng vẫn bị nhuộm bằng tím kết tinh. Nếu bước này được thực hiện quá lâu, nó sẽ làm mất màu cả vi khuẩn gram âm cũng như gram dương. Nên sử dụng mẫu thử để xác định cách thực hiện đúng phương pháp nhuộm này.
Hình 5: Enterobacteriaceae, Vi khuẩn gram âm, quan sát dưới vật kính dầu 100x
Hình 6: Đa sắc tố trong nhuộm gram: vi khuẩn gram dương (màu tím) cũng được nhuộm âm tính (màu hồng đỏ), vật kính ngâm dầu 100x
4. Phân loại vi khuẩn theo hành vi của chúng trong quá trình nhuộm Gram
Vi khuẩn đã nhuộm Gram được quan sát trong trường sáng bằng kính hiển vi quang học (Hình 8). Cần có vật kính có độ mở lớn và độ phóng đại cao để xem các vi khuẩn nhỏ trong kính hiển vi; điều này có thể đạt được với vật kính soi dầu 100x như ZEISS N Achroplan, chẳng hạn. Để xác định chính xác vi khuẩn, khả năng phân biệt đáng tin cậy giữa các sắc thái xanh lam/tím và đỏ là rất quan trọng, điều này có nghĩa là các vật kính được sử dụng cần cung cấp khả năng hiệu chỉnh màu sắc tuyệt vời. Chữ viết tắt “Achro” trong tên của vật kính đề cập đến hiệu chỉnh này. Chỉ có thể khai thác hết tiềm năng của vật kính khi tụ quang cũng có thể thực hiện hiệu chỉnh màu sắc này – giống như tụ quang achromat-aplanatic. Nên sử dụng máy ảnh chuyên dụng cho kính hiển vi có dải động rộng để ghi lại hình ảnh.
Hình 7: ZEISS Axiolab 5
Tóm lại, kính hiển vi quang học có thể được sử dụng để xác định và phân biệt giữa các loại vi khuẩn khác nhau trong phòng thí nghiệm y tế thông qua việc sử dụng các loại thuốc nhuộm phân biệt phù hợp. Nhuộm Gram là một trong những phương pháp nhuộm phổ biến nhất, có thể được sử dụng để dễ dàng phân biệt giữa các loại vi khuẩn khác nhau dựa trên cấu trúc của thành tế bào của chúng. Nên sử dụng mẫu vật được chuẩn bị cẩn thận và vật kính có độ mở lớn, độ phóng đại cao để diễn giải đáng tin cậy các dữ liệu trực quan.
.jpg)