Một trong những bộ phận quan trọng của kính hiển vi huỳnh quang là nguồn sáng. Để tạo ra cường độ ánh sáng kích thích đủ để cung cấp phát xạ có khả năng phát hiện, cần có nguồn sáng mạnh, thường là đèn thủy ngân (HBO), đèn halogen kim loại (HXP), laser và đèn LED.