Đang tải...
Khối phổ (MS) là kỹ thuật có thể phát hiện các chất phân tích dựa vào tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z). Kỹ thuật này đã được sử dụng thường quy trong các phòng thí nghiệm phân tích, phòng nghiên cứu hóa học trong nhiều thập kỷ. Trong những năm gần đây, MS ngày càng được sử dụng nhiều trong các phòng xét nghiệm lâm sàng và xét nghiệm y tế. MS, đặc biệt khi kết hợp với sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng, cung cấp khả năng phân tích đồng thời và thường nhạy hơn, độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp khác. Các ưu điểm khác của MS bao gồm phân tích đồng thời nhiều chất (> 100), độ chọn lọc cao, độ đặc hiệu cao và đặc biệt chính xác, gần như không có hiện tượng dương tính giả, âm tính giả. Các phép phân tích ứng dụng trọng lâm sàng, xét nghiệm y tế thường được đo bởi MS bao gồm thuốc, hormon và protein.
Sử dụng khối phổ trong các phòng xét nghiệm lâm sàng đang phát triển nhanh chóng. Mặc dù được coi là thiết bị quá chuyên biệt và tốn kém cho việc sử dụng thường quy nhưng khối phổ vẫn ngày càng được triển khai trong nhiều phòng xét nghiệm lâm sàng thông thường. Có được điều này là nhờ sự ra đời của các hệ thống khối phổ để bàn, không tốn kém và thân thiện với người dùng. Những ưu điểm chính của phép đo khối phổ bao gồm phân tích đồng thời nhiều chất, nhóm chất, tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chọn lọc cao và giảm hiện tượng dương tính giả, âm tính giả trong phép phân tích. Khối phổ là một công nghệ được ưa thích để phân tích nhiều loại thuốc trong phòng xét nghiệm, hormone, đặc biệt với phân tích mẫu nhỏ (máu, nước tiểu, tóc…) với hàm lượng thấp và siêu thấp (vài ppb tới ppt). Một ứng dụng lâm sàng khác được triển khai tốt của khối phổ là sàng lọc sơ sinh các bệnh chuyển hóa và một số xét nghiệm sinh hóa di truyền. Trong những năm gần đây, các ứng dụng lâm sàng trong lĩnh vực phân tích protein và xác định mầm bệnh nhanh đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Đối với Việt Nam, những nền móng đầu tiên ứng dũng kỹ thuật MS cho chuẩn đoán lâm sàng và xét nghiệm y tế đã được triển khai với sự tham gia của các phòng xét nghiệm của nhà nước (BV Nhi Trung Ương, BV Phụ Sản Hà Nội, BV Phụ sản trung ương…) và đặc biệt là phòng xét nghiệm y tế tư nhân (BV Vimec, BV Tâm Anh…)
Khối phổ là một kỹ thuật phân tích dựa trên nguyên tắc các hạt tích điện di chuyển qua một trường điện hoặc từ có thể được phân tách bằng tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z). Một phân tích khối phổ điển hình có thể được chia thành các bước sau:
Sơ đồ của máy khối phổ với các tùy chọn khác nhau:
GC-MS/ GC-MSMS đã được sử dụng trong các phòng xét nghiệm lâm sàng trong nhiều thập kỷ. Hệ thống GC-MS, GC- MSMS điển hình sử dụng khí heli, cổng tiêm mẫu, cột mao quản, máy khối phổ và hệ thống phân tích dữ liệu. Một quy trình phân tích điển hình liên quan đến chiết chất phân tích từ mẫu, làm giàu mẫu, tạo dẫn xuất nếu hợp chất đích không bay hơi hoặc không bền với nhiệt và tiêm mẫu hệ thống. Khi các ion bị phân mảnh, ghi nhận 1 ion (SIR), ghi nhận 1 ion theo phản ứng cặp me – con (MRM) hoặc tất cả các mảnh được phân tích (theo dõi ion tổng, MS Full Scan). SIR và MRM thường nhạy và độ đặc hiệu cao, dùng trong các phép phân tích định lượng hợp chất đã biết (targeted compound) ở hàm lượng thấp và siêu thấp. MS full scan thường được dùng trong khảo sát các hợp chất chưa biết trong mẫu hoặc sàng lọc định tính diện rộng các hợp chất chưa biết trong mẫu. GC-MS thích hợp để phân tích các phân tử nhỏ dễ bay hơi, không phân cực và ổn định nhiệt.
Trong những năm gần đây, LC-MS, đặc biệt là LC-MS/MS, đã trở nên phổ biến và trở thành phương pháp tiêu chuẩn cho định lượng (tiêu chuẩn vàng cho định lượng), đặc biệt là để phân tích hormone và protein. Số lượng phân tích có thể được đo bằng LC-MS/MS rộng hơn so với GC-MS. Các chất không bền với nhiệt, khó tạo dẫn xuất phù hợp hơn cho LC-MS, LC-MSMS.
Trong TOF-MS, tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion được xác định bằng cách tính thời gian cần thiết để ion di chuyển một khoảng cách cố định vào ống bay. Trong điện trường cố định, các ion nhẹ di chuyển nhanh hơn các ion nặng hơn. Ưu điểm chính của máy phân tích TOF-MS là độ phân giải khối cao và đo khối lượng chính xác. Ví dụ: ở m/z 100 và độ phân giải 2 ppm, sai số khối lượng nhỏ hơn m/z 0,0002. Điều này cung cấp đầy đủ thông tin để gán công thức phân tử ban đầu cho một hợp chất để phát hiện và xác định thêm. TOF-MS phân giải cao đang được sử dụng trong sàng lọc và định danh thuốc và chất chuyển hóa. Phương pháp ion hóa giải hấp thụ laser (MALDI) -TOF đang được sử dụng ngày càng nhiều trong việc định danh protein và vi khuẩn.
Trong TOF-MS, tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion được phân tách bằng cách tính thời gian cần thiết để ion di chuyển một khoảng cách cố định trong ống phòng. Trong điện trường cố định, các ion nhẹ di chuyển nhanh hơn các ion nặng hơn. Ưu điểm chính của máy phân tích TOF-MS là độ phân giải khối cao và đo khối lượng chính xác. Ví dụ: ở m/z 100 và độ phân giải 2 ppm, sai số khối lượng nhỏ hơn m/z 0,0002. Thông thường người ta kết hợp nhiều hơn 1 bộ phân tích khối như TOF/ TOF hoặc QTOF để có thêm thông tin cấu trúc của các chất cần phân tích. Điều này cung cấp đầy đủ thông tin để xác định công thức phân tử ban đầu cho một hợp chất chưa biết hoặc đã biết. TOF-MS/ QTOF phân giải cao đang được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc và định danh thuốc và chất chuyển hóa. Phương pháp ion hóa giải hấp thụ laser (MALDI) -TOF đang được sử dụng ngày càng nhiều trong việc định danh protein, vi khuẩn. QTOF đang sử dụng rất nhiều trong y học, nghiên cứu protein tái tổ hợp và nghiên cứu thuốc mới, vaccine mới…
3. Ứng dụng lâm sàng
MS đang ngày càng được sử dụng trong phòng xét nghiệm lâm sàng để phân tích một loạt các hoạt chất. Các ứng dụng phổ biến nhất của MS là các lĩnh vực theo dõi thuốc điều trị, độc chất, nội tiết và rối loạn chuyển hóa bẩm sinh. Trong những năm gần đây, các
Trong phòng xét nghiệm lâm sàng, xét nghiệm miễn dịch là phương pháp thường được sử dụng để theo dõi thuốc điều trị. Xét nghiệm miễn dịch cũng thường được sử dụng để sàng lọc một số thuốc quá liều. Vì các xét nghiệm miễn dịch không có sẵn cho một số loại thuốc, độ đặc hiệu, độ nhạy không cao, dễ gây dương tính giả, âm tính giả ở mức nồng độ thấp nên MS được sử dụng để phân tích các loại thuốc này và xác nhận lại kết quả mà xét nghiệm miễn dịch dương tính đối với các thuốc quá liều. Mặc dù GC-MS vẫn được sử dụng rộng rãi trong theo dõi thuốc điều trị và độc chất, LC-MS/MS đang được sử dụng ngày càng nhiều nhờ dễ chuẩn bị mẫu. Nhờ sử dụng GC-MS hoặc LC-MS/MS, hơn 100 loại thuốc, chất độc có thể được sàng lọc trong một lần phân tích.
Mặc dù các xét nghiệm miễn dịch vẫn là cơ sở chính để xác định hormon, nhưng MS ngày càng được sử dụng rộng rãi hơn. Các xét nghiệm miễn dịch có hiện tượng không đặc hiệu và không nhất quán, đặc biệt đối với hormon steroid và catecholamine và các chất chuyển hóa của chúng. Ví dụ, xét nghiệm miễn dịch hormon steroid thường đánh giá quá cao nồng độ thực và có sự khác biệt đáng kể giữa các phòng xét nghiệm. Điều này khiến cho việc theo dõi bệnh nhân trong thời gian dài gặp khó khăn do sự khác biệt kết quả ở một phòng xét nghiệm hoặc nhiều phòng xét nghiệm với nhau. Mặc dù cả GC-MS và LC-MS/MS đều được sử dụng để xác định xét nghiệm hormone, nhưng LC-MS/MS đang trở thành một kỹ thuật được ưa thích hơn do dễ dàng chuẩn bị mẫu, độ chính xác và đặc hiệu cao hơn hẳn. Bảng 1 liệt kê các hormon thường được phân tích bằng phương pháp khối phổ.
|
|
|
Khối phổ đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong sàng lọc và xác định rối loạn bẩm sinh của quá trình trao đổi chất. LC-MS/MS được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc sơ sinh để phát hiện nhiều rối loạn chuyển hóa bao gồm rối loạn axit amin, axit hữu cơ và chuyển hóa axit béo. GC-MS đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ và vẫn là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để phân tích axit hữu cơ trong nước tiểu. HPLC kết hợp với đo quang phổ là phương pháp chủ yếu để phân tích các axit amin. Phương pháp này rất tốn thời gian và đang được thay thế bằng LC-MS/MS. Các phân tích khác thường sử dụng để phát hiện các rối loạn chuyển hóa bao gồm acylcarnitine, axit mật, purin và pyrimidine. Bảng 2 và 3 liệt kê các rối loạn được sàng lọc bằng phép đo khối phổ ba tứ cực trong sàng lọc sơ sinh và các rối loạn chuyển hóa khác được chẩn đoán/xét nghiệm bằng phép đo khối phổ.
Các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh được sàng lọc ở trẻ sơ sinh:
|
Rối loạn chu trình axit amin/ure |
Khiếm khuyết oxy hóa axit béo |
|
Phenylketonuria Maple syrup urine disease Homocystinuria Citrullinemia Argininosuccinic aciduria Tyrosinemia |
Medium chain acyl-CoA dehydrogenase Very long chain acyl-CoA dehydrogenase Long chain 3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase Trifunctional protein deficiency Carnitine uptake defect Short chain acyl-CoA dehydrogenase |
|
Axit hữu cơ niệu |
Các rối loạn khác |
|
Isovaleric acidemia Glutaric aciduria 1 and 2 3-Hydroxy-3-methylglutaric aciduria Multiple carboxylase deficiency Methylmalonic acid emia due to mutase deficiency 3-Methylcrotonyl CoA carboxylase deficiency Methylmalonic acid emia due to cobalamin A and B defects Propionic acidemia 3-Ketothiolase |
Acylcarnitines S-adenosylhomocysteine S- adenosylmethionine G-Aminobutyric acid Bile acids synthesis Cholesterol synthesis Disorders of glycosylation Glycosphingolipids Neurotransmitters synthesis Lysosomal disorders Pterins Purine and pyrimidine disorders Succinylacetone |
Trước đây, hầu hết các ứng dụng lâm sàng của MS là phân tích các phân tử nhỏ. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các ứng dụng của MS đang được mở rộng trong việc phân tích các phân tử lớn như protein, lipid, polysacarit và DNA. Ví dụ, MALDI TOF hiện nay thường được sử dụng để nhận dạng nhanh vi khuẩn tới chi, loài. QTOF được sử dụng để nghiên cứu, giải trình tự của chuỗi protein, protein tái tổ hợp. Xác định protein đang cho thấy nhiều hứa hẹn trong lĩnh vực phát hiện sớm ung thư, nâng cao cơ hội chữa trị cho các bệnh nhận ung thư.
Trước khi đưa khối phổ vào phòng xét nghiệm, cần đánh giá cả nhu cầu chăm sóc bệnh nhân và cân nhắc tài chính. Ngoài ra, máy khối phổ cần cơ sở hạ tầng đặc biệt như cung cấp nguồn điện kỹ thuật ổn định, khí có độ tinh khiết cao, điều kiện nhiệt độ ổn định, độ ẩm thấp và tránh các tác nhân gây nhiễu điện từ trường. Bộ lưu điện chuyên dụng (UPS) thường được trang bị để bảo vệ hệ thống đối với trường hợp mất điện đột ngột. Thách thức lớn khác là có được đội ngũ nhân viên đã được đào tạo về vận hành thiết khối phổ, xử lý mẫu, đọc kết quả, kiểm soát kết quả thử nghiệm để triển khai công nghệ này trong các phòng xét nghiệm lâm sàng, y tế. Ngày nay, việc này đã được khắc phục, giảm thiểu rủi ro rất nhiều với sự kết hợp của công nghệ khối phổ, công nghệ vi tính cực kỳ thân thiện, dễ sử dụng và đặc biệt có tính tự động hóa rất cao
Việc triển khai khối phổ phụ thuộc vào nhu cầu cụ thể. Xét về khía cạnh kinh tế, đầu tư ban đầu lớn, mặt khác, khối phổ cho kết quả phân tích vượt trội, phân tích nhanh đồng thời (ví dụ: phân tích hormon steroid hoặc xác nhận lại kết quả miễn dịch dương tính với các thuốc quá liều), lượng mẫu lớn và đồng đều sẽ là yếu tố tốt để cất nhắc đầu tư.
Các xét nghiệm khối phổ được coi là các xét nghiệm có độ phức tạp cao theo CLIA và LDT của FDA. Phòng xét nghiệm có trách nhiệm phát triển phương pháp và đánh giá đặc tính hiệu suất của các xét nghiệm. Một số hướng dẫn CLSI có sẵn như một tài liệu tham khảo cho phép đo khối phổ và giúp đánh giá các thông số trong phát triển phương pháp như giới hạn phát hiện (LoD), giới hạn định lượng (LoQ), độ chính xác, độ lặp lại, phạm vi đo và khoảng tham chiếu. Chuẩn bị mẫu và sử dụng đồng vị làm chuẩn nội là sự độc đáo đối với các xét nghiệm khối phổ. Các đồng vị hoạt động rất giống với các chất phân tích nên làm giảm sự biến đổi khi chiết tách và phân tích mẫu. Sự khác biệt khối lượng giữa chất phân tích và chuẩn nội ít nhất 3 đơn vị khối lượng được ưa chuộng, mặc dù sự khác biệt ít nhất 5 được ưu tiên để loại bỏ nhiễu.
Các bước chính trong việc triển khai khối phổ trong phòng xét nghiệm lâm sàng:
1. Nhu cầu lâm sàng
2. Lựa chọn thiết bị
3. Lựa chọn xét nghiệm
4. Chứng minh tài chính
5. Quy hoạch cơ sở hạ tầng
6. Đào tạo cán bộ và nhân sự
7. Phát triển phương pháp và thẩm định
5. Kết luận
Tóm lại, trong những năm gần đây, khối phổ đã nổi lên như một công cụ quan trọng trong phòng xét nghiệm lâm sàng. Các ứng dụng thường quy chính hiện nay của nó là theo dõi thuốc điều trị, sàng lọc chuyển hóa, nội tiết. Các ứng dụng khác bao gồm: nghiên cứu thuốc mới, nghiên cứu vacxin, giải trình tự proteinomics
(Để trao đổi thêm thông tin chi tiết, tư vấn và tham vấn thêm các vấn đề và giải pháp của khối phổ trong các lĩnh vực, Quý khách vui lòng liên hệ trực tiếp:
Ngọc Việt - Văn Quý - Tổng hợp
