Lựa chọn cột HPLC phù hợp

Từng bước chọn một cột phù hợp tùy thuộc vào vấn đề phân tách

Kể từ khi ra đời phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vào những năm 1960, phương pháp này đã được phát triển và hoàn thiện một cách ổn định. Điều này áp dụng như nhau đối với các vật liệu được sử dụng. Hiện có mười nghìn cột HPLC khác nhau từ nhiều nhà sản xuất khác nhau - chỉ trong trình cấu hình Cột HPLC của chúng tôi, bạn có thể tìm thấy hơn 60.000 cột khác nhau. Sự lựa chọn này đương nhiên mang lại những lợi thế lớn - trong số những thứ khác, có những cột phân tách rất cụ thể cho hầu hết mọi vấn đề phân tách - đồng thời, người dùng tha hồ lựa chọn. Văn bản sau cung cấp hướng dẫn và trợ giúp trong việc lựa chọn cột HPLC thích hợp .

Phần cứng của cột:

Hầu hết các cột HPLC bao gồm thép 316. Ưu điểm là thép chịu áp lực và cũng tương đối trơ với ăn mòn. Để có hiệu suất phân tách tốt, điều quan trọng là bên trong cột không có độ nhám, điểm hoặc cấu trúc vi xốp (Meyer 2009, p. 110).

Vật liệu cơ bản

Gel silica:

Vật liệu cơ bản phổ biến trong hệ thống HPLC là silica gel; nó bao gồm các nguyên tử Si được bắc cầu bởi các nguyên tử oxy (Meyer 2009, trang 119). Một nhược điểm của silica gel là độ pH cao dẫn đến sự hòa tan của khung silica. Cột silica gel có thể được sử dụng trong phạm vi pH từ pH 1 đến 8 (Meyer 2009, trang 120). Hàm lượng kim loại thấp giúp tăng tính ổn định hóa học của gel silica tinh khiết cao. Trên bề mặt, silica gel mang các nhóm OH (nhóm silanol). Các nhóm silanol này có thể được biến đổi về mặt hóa học để thu được các pha tĩnh với các đặc tính cụ thể (Meyer 2009, trang 121). Ngoài tính ổn định cơ học, silica gel có ưu điểm là chi phí thấp và tổng hợp đơn giản. Tương tự như vậy, việc sửa đổi bề mặt rất đơn giản, chi phí thấp và linh hoạt.

Cột polyme:

Cột HPLC dựa trên polyme cũng có sẵn cho RP-HPLC (HPLC pha đảo). Thông thường, các cột polystyrene-divinylbenzen được sử dụng, có độ ổn định pH cao hơn (pH 1-13) so với cột silica gel. Đối với các chất rửa giải có tính axit mạnh hoặc bazơ, chúng đại diện cho một sự thay thế thú vị (cột HPLC 2016). Đặc biệt đối với sắc ký thấm gel, styren-divinylbenzen là một pha tĩnh quan trọng (Meyer 2009, trang 126).

Hình dạng của vật liệu cột

Các hạt hoàn toàn xốp:

Ngoài các pha xốp đầy đủ truyền thống, hiện nay còn có các pha lõi, pha nguyên khối và pha cho UPLC với kích thước hạt nhỏ.
Hầu hết các hạt được sử dụng trong HPLC là các hạt có độ xốp đầy đủ. Kích thước hạt thông thường là 3, 5 hoặc đôi khi cũng là 10 μm. Khi các hạt ở dạng nguyên vẹn, toàn bộ cấu trúc bên trong là xốp và có thể được so sánh, ví dụ, với một miếng bọt biển (Meyer 2009, trang 116).

Hạt lõi:

Hạt lõi có lõi đặc và chỉ có lớp vỏ bên ngoài là xốp. Phần lõi rắn này giúp tăng hiệu suất phân tách. Các hạt có sự phân bố kích thước hạt đồng đều hơn và do đó có thể được đóng gói tốt hơn, số hạng A của phương trình Van-Deemter được giảm xuống. Ngoài ra, sự chuyển khối lượng của các phân tử vào các lỗ rỗng (số hạng C của phương trình Van-Deemter) được tăng tốc. Một nhược điểm của các hạt lõi là khả năng chịu tải thấp hơn so với các vật liệu hoàn toàn xốp.

Pha nguyên khối:

Cột nguyên khối bao gồm một mảnh vật liệu xốp, ví dụ như silica gel hoặc polyme hữu cơ. Do đó, lớp sắc ký không bao gồm các hạt riêng lẻ mà là một thanh xốp. Đá nguyên khối có khả năng phân tách tương đương với các cột hạt đóng gói 3 μm (Meyer 2009, trang 118). Một hạn chế là đối với các pha nguyên khối, khả năng chọn lọc vẫn còn hạn chế so với các vật liệu hoàn toàn xốp (Kromidas 2014, p. 152).

Pha ràng buộc:

Sự đa dạng của các pha tĩnh sẵn có (pha đảo ngược, pha thường, pha phenyl ..) của các nhà sản xuất khác nhau góp phần làm cho việc nhanh chóng tìm được cột HPLC phù hợp không phải lúc nào cũng dễ dàng.
Cột C18 pha đảo phổ biến có thể được sử dụng cho nhiều phép phân tích. Để quyết định pha tĩnh nào là phù hợp, phân tử cần khảo sát nên được xem xét ở bước đầu tiên. Nếu người ta muốn phân tích một phân tử rất phân cực, thì có khả năng nó không tương tác với vật liệu C18 và do đó rửa giải trong thời gian chết. Trong trường hợp này, ví dụ, pha C4, CN, diol hoặc phenyl là phù hợp. Mặt khác, nếu chất phân tích không phân cực quá, nó có thể dính chặt vào vật liệu một cách không thể đảo ngược và do đó không còn rửa giải khỏi cột. Để tránh điều này, bạn có thể thử pha silica, CN hoặc NH2. Điều này thường xảy ra khi chất phân tích chỉ hòa tan trong heptan hoặc hexan (Kromidas 1997, trang 32-33).
Khi quyết định cho giai đoạn được đưa ra, rào cản đầu tiên sẽ được thực hiện. Tuy nhiên, nó thậm chí còn trở nên phức tạp hơn vì người ta phải quyết định giữa các kích thước và thông số kỹ thuật khác nhau cho cột được sử dụng, chẳng hạn như kích thước hạt, kích thước lỗ, đường kính trong, đường kính và hàm lượng cacbon.

 Kích thước hạt

Kích thước hạt nhỏ hơn mang lại độ phân giải tốt hơn các hạt lớn hơn. Mặt khác, các hạt lớn hơn tạo ra áp suất ngược thấp hơn trong hệ thống HPLC. Sự phân bố kích thước hạt đồng đều là đặc biệt quan trọng ngoài kích thước của hạt. Tỷ lệ các hạt nhỏ tăng lên làm tăng áp suất ngược; nếu chứa quá nhiều hạt lớn hơn, vật liệu sẽ mất hiệu suất phân tách do số lượng mặt đất thấp hơn. Nếu sử dụng phân bố kích thước hạt rộng, vật liệu cũng có thể kém hơn (Kromidas 2014, trang 290). Kích thước của hạt có ảnh hưởng đến chất lượng của độ phân giải vì kích thước của các hạt ảnh hưởng đến các số hạng A và C của phương trình Van Deemter.

https://www.analytics-shop.com/media/wysiwyg/Terme_van_Deemter_Gleichung.jpg

Các thuật ngữ của phương trình VanDeemter (chemgepedia 2016)

Hiệu suất phân tách tối ưu đạt được với tầng càng nhỏ càng tốt, do đó tăng tổng số tầng ngăn cách trong cột. Đặc biệt khi số hạng A và C có thể được giảm thiểu, có thể đạt được hiệu suất tách tốt trên một dải lưu lượng lớn.

Kích thước lỗ

Kích thước lỗ xốp được sử dụng phụ thuộc vào kích thước của phân tử được phân tích: phân tử càng lớn thì lỗ xốp càng lớn. Kích thước lỗ thường được đưa ra trong angstrom, tương ứng với 10 Å = 1 nm. Đối với các phân tử nhỏ, có thể sử dụng cột lên đến 120 Å. Ví dụ, đối với các phân tử sinh học lớn, các cột có kích thước lỗ là 3000 Å là phù hợp (Kromidas 2014, trang 291). Đối với các phân tử sinh học, việc lựa chọn kích thước lỗ chân lông chính xác là đặc biệt quan trọng vì nó có nhiều loại kích thước. Lỗ rỗng càng nhỏ thì pha càng có nhiều bề mặt và khả năng tương tác. Điều này cho phép chúng được tải cao hơn (Kromidas 2014, p. 291).

Bảng 1: Các phân tử sinh học của công cụ chọn cột (YMC 2015)

MW

Å

C18

C8

C4

 

120

+++

++

+

> 5000

200

++

+++

++

> 20000

300

+

++

+++

(+++) = rất tốt; (++) = tốt; (+) = bình thường

Đường kính trong / chiều dài

Tùy thuộc vào dạng phân tích và lượng chất cần phân tích, kích thước của cột HPLC nên được chọn. Hệ thống HPLC cũng hạn chế nhiều loại kích thước có sẵn (Moldoveanu & David 2013, trang 227).

Bảng 2: Phân loại cột HPLC theo kích thước (Moldoveanu & David 2013)

 

Đường kính bên trong (mm)

Chiều dài (mm)

Tốc độ dòng  (ml / phút)

Lượng mẫu (µg)

So sánh

> 25

300 hoặc lớn hơn

> 20

> 25000

Bán dự bị

10

250 hoặc lớn hơn

5-10

10000-20000

Phân tích thông thường

3; 4; 4,6

50; 100; 150; 250

0,5-2

50-200

Phân tích hẹp

2; 2.1

50; 100; 150; 250

0,2-0,5

20-100

Kết luận

Rõ ràng là khi chọn một cột HPLC phù hợp, nhiều thông số khác nhau phải được xem xét. Thường không có một cột đúng, nhưng bạn thường có nhiều tùy chọn có thể thích hợp cho phân tích. Nếu các thông số cột được lựa chọn cụ thể cho chất phân tích và thiết bị dụng cụ được tính đến, thì có thể giả định rằng có được sự phân tách sắc ký thích hợp.

Nếu bạn vẫn không chắc chắn về việc lựa chọn cột, các chuyên gia sản phẩm của chúng tôi từ Thăng Long Instruments sẽ sẵn lòng tư vấn cho bạn. Chúng tôi sẽ vui lòng cung cấp cho bạn các đề xuất mà không có bất kỳ nghĩa vụ nào từ các nhà sản xuất khác nhau tùy thuộc vào vấn đề phân tách. Đôi khi có khả năng nhận được một cột kiểm tra miễn phí, chỉ cần liên hệ với chúng tôi.