Tối đa hóa tuổi thọ cột sắc ký: 3 mẹo giảm sự xuống cấp hóa học của cột

1. Hiểu rõ điều kiện làm việc của cột

Làm theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất về khoảng nhiệt độ vận hành của cột, pH của pha động, và các phụ gia đệm sẽ cải thiện đáng kể tuổi thọ và hiệu năng của cột.

Làm cách nào để tối đa hóa tuổi thọ của cột sắc ký?

Ví dụ, lớp đệm cột sắc ký pha đảo nền silica là rất ổn định ở nhiệt độ phòng đối với hầu hết pha động có pH trong khoảng 2 đến 8; nếu sử dụng hybrid-silica thì có thể làm việc trong khoảng 1-12. Tuy nhiên, nếu bạn tăng nhiệt độ, đặc biệt ở pH gần với giới hạn của cột thì tuổi thọ cột sẽ giảm nhanh chóng. Điều này có thể gây ra vấn đề, vì một số phương pháp trong USP làm việc ở pH bằng hoặc gần 7. Kết hợp điều kiện này với nhiệt độ cao sẽ làm giảm tuổi thọ cột do sự hòa tan của các hạt đệm nền silica. Quá trình này thường tạo ra khoảng trống trong pha tĩnh ở phía đầu cột, gây ra peak có hình dáng bất thường và trong một số trường hợp gây tách các peak.


Ở điều kiện pH pha động nhỏ hơn, ligand có thể bị thủy phân và tách ra khỏi bề mặt pha tĩnh và làm tăng phần kéo đuôi và giảm thời gian lưu.

Lựa chọn ion đệm trong pha động đóng có ảnh hưởng nhiều đến sự xuống cấp của cột. Đệm phosphate thường được sử dụng nhưng không phải là lựa chọn tốt nhất; dung dịch đệm hữu cơ như TRIS hay citrate sẽ cho kết quả tốt hơn rất nhiều. Nhìn chung, dung dịch đệm hữu cơ ít gây ăn mòn đối với bề mặt silica hơn. Ngoài ra, nồng độ dung dịch đệm càng thấp thì tuổi thọ cột càng cao.
2. Cân bằng hóa và hoạt hóa cột đúng cách

Thời gian cân bằng hóa cột phụ thuộc vào thành phần và nồng độ của pha động. Thông thường, pha động càng đậm đặc thì thời gian cân bằng hóa càng ngắn. Yếu tố quan trọng trong cân bằng hóa cột là thể tích pha động. Thông thường, thể tích được khuyến cáo là 5 đến 10 thể tích trống của cột.
Cân bằng hóa cột gây ra các hiện tượng có thể đảo ngược, trong khi hoạt hóa cột thay đổi cột vĩnh viễn. Do đó, hoạt hóa cột có ảnh hưởng lớn đến tuổi thọ cột. Vì vậy lời khuyến cáo là nên hạn chế hoạt hóa cột, tuy nhiên trong một số trường hợp việc này là không thể tránh khỏi. Ví dụ, trong quá trình phân tách cặp ion yêu cầu cân bằng hóa và hoạt hóa để có thời gian lưu ổn định. Trong trường hợp này, các chất phụ gia tương tác với bề mặt pha tĩnh tạo ra hiệu ứng hóa học mong muốn. Vì lý do này, cột được hoạt hóa theo cách này chỉ nên dùng cho một phương pháp riêng biệt.
Khi đã được hoạt hóa, cột sẽ không làm việc tốt với các phương pháp thông thường nữa, và không nên sử dụng chúng để phát triển phương pháp mới.

3. Bảo quản cột đúng cách

Cách thuận tiện nhất để cất trữ cột là trong pha động thường dùng. Ưu điểm lớn nhất của cách này là sự cân bằng giữa cột và pha động diễn ra rất nhanh. Cách này được đặc biệt khuyến cáo cho sắc ký pha thuận, bởi sự thay đổi dung môi cất trữ có thể khiến cho thời gian cân bằng hóa dài hơn.

Điều kiện lý tưởng để cất trữ cột sắc ký phụ thuộc vào loại pha động. Cột với pha liên kết thường thay đổi chậm khi bảo quản bằng pha động và các phụ gia thông thường. Do đó, sự thuận tiện khi bảo quản cột trong pha động cần phải được cân bằng với sự giảm tuổi thọ cột. Các loại cột C8 và C18 thông thường đủ ổn định để bảo quản trong vòng vài tháng mà độ kỵ nước không thay đổi. Tuy nhiên, các pha liên kết dựa trên các chuỗi ngắn hơn có thể bị thủy phân đáng kể chỉ trong vài tuần.
Điều kiện bảo quản tốt nhất đối với cột pha đảo tùy thuộc vào tần suất sử dụng. Nếu cột được sử dụng hàng ngày, hoặc vài ngày một lần, cách bảo quản thuận tiện nhất là trong pha động. Nếu cất trữ lâu hơn cần tráng cột bằng dung dịch đệm muối. Ngoài ra, việc rửa cột cũng cần lưu ý, trong một số trường hợp như protein kết tụ bên trong cột, khi bạn cố gắng rửa chúng thì chúng cũng sẽ bị già hóa hoặc liên kết chéo khiến chúng không thể bị hòa tan.

Ngoài ra, mỗi lần rửa hoặc thay đổi dung môi cũng đồng thời loại bỏ pha liên kết thủy phân. Do đó, việc rửa cột quá thường xuyên và không cần thiết có thể đẩy nhanh quá trình lão hóa cột do lớp ligand liên kết bị rửa trôi. 

Thanh Son