Đang tải...
Cách mạng trong ghi tín hiệu không phụ thuộc: Giới thiệu ZT Scan DIA cho phân tích định lượng protein
Rebekah Sayers, Katherine Tran và Neil Walsh
SCIEX, Anh và SCIEX, Canada
Giới thiệu: Tìm hiểu về chế độ phân tích ZT Scan DIA mang tính cách mạng về hiệu suất và thông lượng trên dòng khối phổ phân giải cao mới nhất từ SCIEX, LC-QTOF 7600+. Bài viết này dịch và giải thích phần lớn nội dung của tài liệu “Continuing the data independent acquisition (r)evolution: Introducing ZT Scan DIA for quantitative proteomics, Link gốc: https://sciex.com/technology/zt-scan-dia/continuing-the-data-independent-acquisition-revolution-introducing-zt-scan-dia-for-quantitative-proteomics#zt”, cung cấp 1 số kiến thức liên quan tới SWATH DIA, Zeno SWATH DIA và ZT Scan DIA. Về người biên tập, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá (metabolites) và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492.
Tóm tắt: Ghi tín hiệu không phụ thuộc (DIA) đóng vai trò vô cùng then chốt trong việc chuyển đổi khoa học omic dựa trên khối phổ (MS) từ một ngành khoa học tập trung vào khám phá sang một ngành khoa học toàn diện hơn, tạo điều kiện cho các nghiên cứu theo chiều dọc (longitudinal studies), như yêu cầu trong nghiên cứu lâm sàng và y học chính xác. Những thách thức liên quan đến việc cải thiện thông lượng trong MS độ phân giải cao, đồng thời tối đa hóa độ sâu, độ tái lặp và độ chính xác định lượng, đã dẫn đến sự ra đời của ZT Scan DIA.
ZT Scan DIA là cuộc cách mạng tiếp theo của SCIEX trong lĩnh vực ghi tín hiệu DIA, sau SWATH DIA và gần đây nhất là Zeno SWATH DIA. Kể từ khi SCIEX ra mắt SWATH DIA vào năm 2011, việc ghi tín hiệu không phụ thuộc ngày càng trở thành phương pháp được lựa chọn của các nhà nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng ghép nối với khối phổ hai lần (LC-MS/MS). SWATH DIA nổi lên như một quy trình LC-MS/MS tận dụng được tốc độ và độ nhạy có thể đạt được với các hệ thống MS hiện đại. SWATH DIA cho phép xác định số lượng lớn protein, peptide và chất chuyển hóa một cách toàn diện hơn so với các phương pháp ghi dữ liệu phụ thuộc(DDA) thông thường. Với SWATH DIA, dữ liệu MS2độ phân giải cao, chất lượng cao không chỉ cung cấp khả năng định danh mà còn là bí quyết đằng sau định lượng chính xác và tái lặp.
Sự phát triển của bẫy Zeno (Zeno trap), một thiết bị cho phép bắt giữ và đẩy ion theo xung mới tích hợp trong các dòng SCIEX ZenoTOF 7600/7600+, đã mở ra một kỷ nguyên mới về độ nhạy cho các thiết bị phân tích khối chính xác. Trong Zeno SWATH DIA, bẫy Zeno khi kích hoạt sẽ cho phép tăng độ nhạy MS2cho mỗi cửa sổ khối biến thiên được thu thập (với SWATH, các khoảng khối/cửa sổ khối sẽ được phân lập lần lượt và đưa vào phá mảnh thay vì từng số khối đơn lẻ). Bẫy Zeno cung cấp mức tăng độ nhạy từ 4-20 lần so với chế độ SWATH DIA thông thường, đồng thời duy trì các tính năng hiệu suất quan trọng khác.
Trong bản tổng quan kỹ thuật này, SCIEX giới thiệu một phương pháp ghi tín hiệu DIA mới, ZT Scan DIA, kết hợp độ sâu của các phương pháp DIA với độ chính xác của các phương pháp phân tích có mục tiêu. Tương tự như Zeno SWATH DIA, ZT Scan DIA cho phép định tính và định lượng các chất phân tích bằng cách sử dụng dữ liệu MS/MS. Do đó, khả năng thu thập nhanh chóng dữ liệu MS2 chất lượng cao trên toàn bộ không gian ion tiền chất (entire precursor ion space) là điều quan trọng nhất. Với chiều dữ liệu bổ sung từ việc quét tứ cực, kỹ thuật ZT Scan DIA cho phép các nhà nghiên cứu khám phá toàn diện hơn sự phức tạp của các mẫu sinh học bằng cách mở rộng độ sâu và độ chắc chắn trong phép đo định lượng.
Các điểm thay đổi chính của ZT Scan DIA
Hình 1. Chế độ xem dữ liệu thô (chưa qua xử lý) đa chiều của ZT Scan DIA. Dữ liệu thô cho thấy một chu kỳ (cycle) ZT Scan DIA đơn được chọn (Mẫu K562 cell line, 200 ng, RT 12,14 phút, gradient 15 phút), phần không gian nằm giữa 2 đường gạch chéo nối tiếp, 1 chu kỳ ZT SCAN DIA ghi tới 255 phổ MS2 cho khoảng khối phân lập từ 400-900 Da chỉ mất 0,78 giây
Sự cần thiết của DIA?
LC-MS/MS được sử dụng rộng rãi để phân tích đặc tính của hỗn hợp các hợp chất chưa biết. Trong phương pháp thông thường, DDA được sử dụng để thu thập dữ liệu MS2 trên càng nhiều hợp chất càng tốt. DDA được thiết lập tốt và được sử dụng trong nhiều ứng dụng, do có thể cung cấp khả năng phân tích mẫu không cần biết mục tiêu cho trước. Tuy nhiên nhược điểm lớn của DDA là các file dữ liệu có thể không chứa đầy đủ thông tin của các chất quan trọng vì chỉ các ion tiền chất phù hợp với các tiêu chí cụ thể mới được chọn để phân tích MS/MS. Ngoài ra, khả năng tái lặp phát hiện có thể bị ảnh hưởng. Sự thay đổi nhỏ về thời gian lưu giữa các lần chạy có thể ảnh hưởng đến các ion tiền chất đi vào thiết bị trong mỗi chu kỳ, và do đó, các hợp chất có thể được phân tích. Mặc dù có những tiến bộ gần đây trong hiệu suất của công nghệ MS, những vẫn còn nhiều hạn chế liên quan tới việc phân tích đặc tính các hợp chất trong nền mẫu có độ phức tạp cao. Để giải quyết điều này, có thể sử dụng danh sách mục tiêu các tiền chất để tập trung phân tích vào các chất phân tích mong muốn, tuy nhiên điều này không tận dụng được lợi ích của một phương pháp tổng quát và gây ra sự thiên lệch về 1 giả thiết cho trước (bias). Do đó, khi so sánh nhiều tập dữ liệu DDA, nhiều píc thường bị mất, điều này có thể tác động tiêu cực đến việc phát hiện các chất phân tích ở mức nồng độ thấp.
Phân tích DDA thường sử dụng số khối tiền chất nguyên vẹn (intact precursor mass) được tìm thấy trong dữ liệu quét toàn bộ MS1 (trong DDA, 1 full MS survey scan sẽ được chạy trước, và phần mềm sẽ chọn các ion tiền chất phù hợp theo yêu cầu để tiến hành tự động phá mảnh) để định lượng và định danh chất. Tuy nhiên các hợp chất đồng khối và có cùng thời gian lưu, chất bẩn và nền mẫu cao trong mẫu vẫn có thể ảnh hưởng tới việc tự động lựa chọn các ion tiền chất, ngay cả khi sử dụng độ phân giải rất cao. Việc sử dụng dữ liệu của các ion phân mảnh ở mức MS2 (MS/MS) có thể cải thiện đáng kể khả năng định lượng, vì nền mẫu và nhiễu có thể được loại bỏ gần như hoàn toàn (do các chất cản trở trên hầu như không tạo ra các ion phân mảnh đặc thù của chất phân tích). Hơn nữa, sử dụng dữ liệu mức MS2 giúp giảm các bước chuẩn bị mẫu bổ sung hoặc sử dụng các gradient sắc ký dài hơn (do tính đặc hiệu được tăng thêm nhờ thông tin từ MS2).
Khi độ phức tạp của mẫu tăng lên hoặc cần sử dụng sắc ký nhanh hơn, nhiều hợp chất hơn sẽ được rửa giải trong một đơn vị thời gian nhất định. Điều này có thể làm trầm trọng thêm bất kỳ vấn đề nào gặp đã phải ở cấp độ MS1. Sử dụng độ phân giải cao ở mức MS2 cho phép sử dụng các ion phân mảnh quan trọng, ngay kể cả khi có nhiễu, cho phép tăng cường giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) cũng như độ chính xác định lượng (do ảnh hưởng tới từ nền mẫu và các chất cản trở có thể được loại bỏ). Độ dài gradient ngắn hơn cũng có nghĩa là cần thời gian chu kỳ (cycle time, là thời gian thiết bị hoàn thành việc ghi tín hiệu giữa 2 lần ghi tín hiệu liên tiếp, ví dụ: với 1 lần ghi tín hiệu DDA với thiết lập ghi 10 phổ MS2 cho các ứng viên, thì tổng thời gian ion được sinh ra, di chuyển trong hệ, đi tới detector, ghi xong 1 phổ MS survey scan, chọn lọc 10 ion ứng viên, phá mảnh lần lượt và ghi 10 phổ MS2 là 1 cycle time; nếu cylce time quá dài, thì nhiều chất sẽ bị bỏ sót và không được ghi tín hiệu) ngắn hơn để cung cấp số lượng điểm dữ liệu tối thiểu cho mọi chất phân tích. Để cung cấp định lượng tốt, cycle time phải đủ nhanh để mỗi chất phân tích ghi tín hiệu tối thiểu 10 lần trên píc LC của nó (Eurochem guidline khuyến cáo 1 píc LCMS cần có từ 12-15 điểm ghi dữ liệu). Do đó, số lượng lần quét (number of scans) và thời gian tích lũy (accumulation time, là thời gian mà các phổ MS của cùng 1 chất sẽ được ghi tín hiệu và cộng dồn để tăng tín hiệu) phải được cân bằng cẩn thận để có được cycle time phù hợp cho phép cung cấp đủ điểm dữ liệu cho píc sắc ký của chất đã chọn. Tuy nhiên việc tối ưu tất cả các thông số này đòi hỏi người sử dụng phải có nhiều kinh nghiệm phân tích với đối tượng mẫu, và ngay cả khi đã tối ưu giữ liệu MS2 của DDA trong nhiều trường hợp vẫn thiếu khả năng tái lặp cũng như độ chính xác để có thể định lượng chất lượng cao trong các nghiên cứu sinh học.
DIA (r)evolution – Sự tiến hoá (cách mạng) của DIA
Mục tiêu chính của các phương pháp DIA là phân mảnh tất cả các chất phân tích trên phạm vi m/z đã chọn bất kể cường độ của chúng. Do đó, không giống như DDA, việc tạo ra dữ liệu MS2 không phụ thuộc vào việc phát hiện ion tiền chất trong MS survery scan ban đầu. Tuy nhiên, việc giải thích các phổ kết quả có thể gặp nhiều thách thức do độ phức tạp của dữ liệu MS2. Do đó, hiệu quả của bất kỳ phân tích dựa trên DIA nào có liên quan đến mức độ chọn lọc (selectivity) trước khi phân mảnh và phát hiện ion tiếp theo. Phương pháp mang tính chọn lọc nhất trong số các phương pháp DIA là quy trình MS/MSALL dựa trên việc bơm mẫu trực tiếp (direct infuse), thu được phổ ion sản phẩm của tất cả các tiền chất trong phạm vi khối được chỉ định. Một thí nghiệm điển hình bao gồm 1 việc quét TOF MS từ m/z 200-1500, tiếp theo là thu thập tuần tự 1001 phổ MS2 thu được từ m/z 200,015 đến 1200,051, với kích thước bước là 1 Da. Trong thí nghiệm MS/MSALL, một file kết quả bao gồm tất cả các ion tiền chất, ion sản phẩm và ion mất trung tính (neutral loss) trong một mẫu đã được thu thập. MS/MSALL là một phương pháp mạnh mẽ để định lượng các lipid không mục tiêu, nhưng nếu không có hỗ trợ của sắc ký, quy trình này không thể áp dụng cho phân tích proteomics của các mẫu phức tạp.
Năm 2012, chiến lược ghi tín hiệu DIA Sequential Windowed Acquisition of All Theoretical Fragment Ion Mass Spectra (SWATH-MS) được công bố lần đầu tiên [5]. Với SWATH DIA, tất cả các tiền chất có thể ion hóa đều được phân tích bằng MS2 bất kể mức tín hiệu hoặc các tiêu chí nào khác. Điều này dẫn đến khả năng phân tích tái lặp lớn hơn nhờ ghi việc ghi được tập dữ liệu hoàn chỉnh hơn chứa thông tin phân mảnh cho tất cả các ion tiền chất. Mặc dù SWATH DIA ban đầu được sử dụng cho các ứng dụng proteomics, nhưng quy trình này đã được áp dụng cho nhiều ứng dụng khác, bao gồm nghiên cứu chất chuyển hóa, sàng lọc môi trường, kiểm tra thực phẩm, pháp y và phân tích dược phẩm [6]. Trong SWATH DIA, các cửa sổ lựa chọn tiền chất rộng hơn được sử dụng cho MS2 cho phép nhiều hợp chất đi qua đồng thời. Các cửa sổ này trải dài trên toàn bộ phạm vi khối tiền chất (stepped across the entire precursor mass range) sao cho tất cả các khối tiền chất bị phân mảnh cho mỗi chu kỳ (ghi tín hiệu). Ví dụ, trong SWATH DIA, lần lượt các khoảng m/z cách nhau 99 Da 100 – 199, 200 – 299, 300 – 399… 900 – 999 sẽ được phân lập bởi Q1 và tất cả các ion tiền chất có thể có trong từng khoảng khối này sẽ được phá mảnh ở Q2 và ghi tín hiệu (Hình 2). So với DDA, phổ MS2 được tạo ra bởi SWATH DIA có xu hướng phức tạp hơn. Việc sử dụng độ rộng cửa sổ biến đổi (variable window widths) làm tăng thêm tính chọn lọc của SWATH DIA (ví dụ, phương pháp SWATH DIA sẽ có các cửa sổ khối có độ rộng khác nhau như sau m/z 100-149, 150-249, 250-499…). Với các cửa sổ biến đổi, độ rộng của mỗi cửa sổ tiền chất được điều chỉnh theo mật độ của các ion tiền chất có trong phạm vi khối đó. Các cửa sổ rất hẹp được sử dụng khi mật độ ion tiền chất là lớn nhất và các cửa sổ rộng hơn được sử dụng khi các ion tiền chất được phân bố rải rác hơn, từ đó tối ưu hơn cycle time và độ phức tạp của dữ liệu phổ MS2. Tính chọn lọc và độ đặc hiệu tăng cường có thể cải thiện rất nhiều chất lượng của dữ liệu thu được. Độ rộng cửa sổ phân lập các tiền chất (precursor isolation window widths) này thường dao động từ 2-50 Da (hoặc rộng hơn). Ngay cả khi hai hoặc nhiều hợp chất rơi vào cùng cửa sổ phân lập tiền chất và có thời gian lưu tương tự, việc giải chập cho phổ MS2 (deconvolution of the MS/MS, là việc do rất nhiều ion tiền chất được phân mảnh cùng 1 lúc phần mềm sẽ sử dụng thuật toán để kết nối thông tin của các phân mảnh này với ion tiền chất tương ứng, có thể được làm dễ dàng trên SCIEX OS hoặc MS-DIAL) thường có thể thực hiện được bằng các kỹ thuật dựa trên đồng tương quan hồ sơ LC (based on LC profile correlation, việc giải chập tương đối phức tạp nhưng có thể dựa trên thông tin về thời gian lưu của chất cũng như sự đồng tương quan giữa tín hiệu của ion tiền chất và ion sản phẩm (cùng tăng, cùng giảm); ví dụ, nếu ở cùng 1 thời gian lưu, sự thay đổi về tín hiệu của ion tiền chất và ion sản phẩm có sự đồng tương quan cao, như vậy nhiều khả năng các ion này có liên quan tới nhau). Tuy nhiên, khi hai hoặc nhiều hợp chất rơi vào cùng một cửa sổ phân lập tiền chất và có thời gian lưu giống hệt nhau, thì việc giải chập các tín hiệu phân mảnh là không thể. Một giải pháp là thiết kế các cửa sổ phân lập tiền chất SWATH DIA sao cho mỗi chất nội chuẩn rơi vào 1 cửa sổ phân lập hẹp riêng (narrow isolation window). Tuy nhiên, điều này sẽ làm cho phương pháp này trở nên rất cụ thể đối với các hợp chất được đo. Việc thêm các hợp chất mới vào phương pháp này sẽ yêu cầu việc tái thiết kế và tối ưu phương pháp, điều nàymô hình chung lại làm phương pháp SWATH mất đi tính dễ sử dụng và tính tổng quát. Những vấn đề này có thể trở nên nghiêm trọng hơn khi sử dụng các phương pháp sắc ký ngắn để tăng thông lượng. Từ đó nảy sinh yêu cầu liên quan tới việc sử dụng các phương pháp MS với thời gian ghi tín hiệu nhanh hơn mà vẫn đảm bảo được các ưu điểm về tốc độ và tính hiệu dụng cũng như tính tổng quát.
Các phương pháp phân tích thông lượng cao bị giới hạn bởi tốc độ ghi tín hiệu của thiết bị MS và sự xuất hiện của nhiễu tín hiệu. Cycle time ngắn là rất cần thiết để đảm bảo rằng có đủ các điểm dữ liệu được ghi cho mỗi píc sắc ký và cho phép định lượng chính xác. Để đạt được điều này với các gradient nhanh, các phương pháp DIA sẽ phải hy sinh tính chọn lọc bằng cách sử dụng các cửa sổ phân lập DIA rộng hơn hoặc độ nhạy bằng cách giới hạn thời gian ghi tín hiệu cho các cửa sổ MS2 riêng lẻ. Cả hai yếu tố đều có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của việc định lượng và định danh peptide và protein. Những nhu cầu và thách thức này đã dẫn đến sự phát triển của một kỹ thuật DIA thay thế được gọi trước đây là Scanning SWATH acquisition [7,8]. Kỹ thuật SWATH này sẽ quét liên tục sử dụng tứ cực Q1 dọc theo phạm vi khối, thay vì theo các bước rời rạc như với SWATH DIA. Các sự kiện ion (ion events, là chỉ chung tất cả các việc phân giải sắc ký, ion hoá, ghi tín hiệu MS1, ghi tín hiệu MS2 cho các ion) được ghi lại dọc theo mỗi xung TOF một cách đồng bộ khi Q1 được tăng lên (tức là, khi Q1 quét lần lượt, thì TOF cũng quét ghi tín hiệu đồng bộ theo từng xung ion được đẩy vào ống bay). Bằng cách này, mọi sự kiện ion được đặc trưng bởi 3 tọa độ độc lập: m/z, thời gian lưu LC (RT) và vị trí của cửa sổ Q1. Chiều Q1 cung cấp thông tin được sử dụng để xác định các ion phân mảnh bằng cách đồng tương quan sự xuất hiện/biến mất của chúng với sự hiện diện của tiền chất trong cửa sổ phân lập Q1 tại một thời điểm nhất định. Ngoài ra, chiều Q1 này từ việc ghi tín hiệu Scanning SWATH sẽ phân biệt được tín hiệu của tiền chất với bất kỳ tín hiệu gây nhiễu nào ở cùng m/z đến từ việc ion mảnh nội tại (internal fragment, không phải tất cả các ion mảnh được tạo ra đều là kết quả của sự đứt gãy trực tiếp liên kết peptide, một số ion mảnh có thể là kết quả của sự tái sắp xếp hoặc mất các nhóm chức năng và được gọi là internal fragment), các adduct hoặc việc mất khối xảy ra ở năng lượng va chạm thấp, do đó dẫn đến phổ sạch hơn so với quét MS1 đơn giản. Tuy nhiên, các yêu cầu để cải thiện độ nhạy và tăng tốc độ phân tích vẫn còn.
Hình 2. Tối ưu hóa độ rộng cửa sổ Q1 để ghi tín hiệu SWATH DIA. Khi thực hiện SWATH DIA, các cửa sổ phân lập Q1 được lần lượt bước qua các phạm vi khối và phổ MS2 độ phân giải cao được thu thập trong một thời gian tích lũy cụ thể ở mỗi bước. Khi thiết kế một phương pháp cho một thí nghiệm SWATH DIA, phải tối ưu hóa kích thước cửa sổ Q1, thời gian tích lũy và cycle time để đạt được sự cân bằng giữa độ nhạy và độ đặc hiệu. Giải thích trong hình: mỗi mũi tên 2 đầu thể hiện 1 khoảng khối phân lập của Q1 (Q1 window), các khoảng khối này sẽ trải đều khoảng m/z quan tâm (trục đứng, m/z), chiều dài các mũi tên bằng nhau thể hiện đây là phương pháp sử dụng cửa số khối có độ rộng cố định; độ dày của mũi tên đen là thời gian tích luỹ phổ MS2 (MS/MS accumulation time); khoảng cách giữa 2 mũi tên đen đứt đoạn mô tả cycle time của phương pháp (thời gian hoàn thành xong 1 lần ghi tín hiệu SWATH DIA), và tính bằng số khoảng khối nhân với thời gian tích luỹ MS2 cho từng khoảng khối.
Hình 3. Sơ đồ kiểm soát ion và chu kỳ làm việc trong (a) QTOF truyền thống hoặc (b) QTOF hỗ trợ bẫy Zeno. (a) trong thiết kế QTOF truyền thống, các ion bị mất vào chân không khi ống TOF đang được sử dụng dẫn đến duty cycle không hiệu quả ảnh hưởng đến độ nhạy của thiết bị và việc thu giữ các ion không được kiểm soát trong bộ đẩy ảnh hưởng đến độ lệch khối lượng (b) các ion được tích lũy trong Zeno trap ở lối ra của buồng va chạm Q2, sau đó được giải phóng dựa trên thế năng, thường theo thứ tự khối ngược lại (khối lớn bay chậm được đi ra trước sao cho cả ion nặng và ion nhẹ tiến vào bộ gia tốc cùng lúc), để đồng bộ hóa với mỗi xung tăng tốc, cải thiện độ nhạy >10x và việc các ion tiến vào bộ đẩy 1 cách tuần tự giúp loại bỏ độ lệch khối.
Công nghệ bẫy Zeno
Các thiết bị tứ cực thời gian bay (QTOF) thường sử dụng quá trình đưa các ion trực giao sinh ra từ buồng va chạm kiểu tứ cực (Q2) vào vùng ống bay (nếu mô tả trên mặt phẳng 2D thì có thể mô tả đơn giản là ống bay được đặt vuông góc với chiều ion di chuyển sau khi đi ra khỏi buồng phá mảnh), vì cấu hình này cho phép tối đa hóa độ phân giải TOF, độ chính xác khối và độ nhạy cho toàn bộ phổ mà không cần quét. Tuy nhiên, loại xung ion (ion pulse, là 1 xung kéo đẩy áp dụng lên các ion sinh ra từ Q2 tiến vào khu vực extract region, đầu tiên các ion sẽ bị kéo lại thành 1 gói các ion, trước khi được đẩy dọc lên theo ống bay, do sử dụng chu kỳ xung này, mà sẽ có khoảng trống giữa các lần đưa ion vào ống bay) này bị ảnh hưởng bởi chu kỳ làm việc tương đối thấp (low duty cycle) (Hình 3a). Thông thường, chỉ có 5-25% ion có thể được đẩy ra với mỗi xung của bộ gia tốc nằm trong khu vực extraction region, tùy thuộc vào hình dạng (geometry) và phạm vi m/z. Điều này thường không phải là vấn đề khi chỉ cần phân tích MS1, vì dòng ion được tạo ra bởi các nguồn hiện đại (chẳng hạn như nguồn ion Turbo V) và được truyền bởi công nghệ thu giữ ion hiện đại (chẳng hạn như bộ dẫn hướng ion QJet) có hiệu suất rất cao và cần phải giảm bớt để ngăn chặn sự bão hòa và bảo vệ tuổi thọ của đầu dò trang bị trên MS TOF. Tuy nhiên, khi cần ghi phổ MS/MS, việc cải thiện duty cycle có thể dẫn đến những cải thiện đáng kể về độ nhạy.
Sự mất ion thường xảy ra ở vùng trôi (drift region) giữa buồng va chạm Q2 và bộ gia tốc TOF nằm ở extract region, trong khu vực trôi này các ion thường phân tán ở nhiều vị trí (widely distributed positionally). Do đó, chỉ một phần của các ion phân mảnh này (a fraction of the fragment ion slice) (nằm ở vị trí thích hợp nơi áp dụng xung) được áp xung, đẩy vào ống bay và được phát hiện. Một phần đáng kể các ion sẽ bị mất đi cho mỗi xung. Trước đây, đã có nhiều nỗ lực để khắc phục sự thiếu đồng bộ này. Tuy nhiên, các nỗ lực này chỉ đạt hiệu quả cho phạm vi khối hẹp hoặc ở tần số ghi tín hiệu thấp.
Bẫy Zeno cho phép vượt qua những rào cản công nghệ này để phục hồi việc giảm duty cycle trên toàn bộ khoảng khối với tần số ghi tín hiệu lên đến 133 Hz (133 phổ/giây) (Hình 3b). Điều này đạt được bằng cách sử dụng một bẫy ion tuyến tính, được gọi là Zeno trap, ở lối ra của buồng va chạm Q2. Cơ chế bẫy và giải phóng các ion được thể hiện trong Hình 3b. Các ion đi vào bẫy ion và được giữ lại các rào cản điện thế áp lên các thấu kính Zeno Gate và IQ3, trong khi các gói ion tiếp theo được tích lũy trong buồng va chạm LINAC (Q2), ngăn chặn sự mất ion. Các ion bị bẫy được làm nguội về mặt năng lượng và sau đó được giải phóng dựa trên thế năng dẫn đến việc giải phóng có trật tự từ m/z cao đến m/z thấp. Bằng cách này, các ion trên toàn khoảng khối có thể đến vùng xung của bộ gia tốc TOF. Cơ chế bẫy và giải phóng đơn giản này cho phép những cải tiến đáng kể về độ nhạy MS/MS (Hình 4). Ghi tín hiệu MS2 khi bẫy Zeno được kích hoạt dẫn đến mức tăng tín hiệu từ 4 đến 15 lần (hoặc lớn hơn), với mức tăng lớn hơn ở các khoảng m/z thấp. Hiệu quả của bẫy Zeno kết hợp với thời gian giải phóng ion chính xác mang lại ≥90% mức tăng lý thuyết trên toàn bộ phạm vi khối. Do mức độ chọn lọc được kích hoạt bằng dữ liệu MS2 độ phân giải cao, sự tăng cường về tín hiệu này được kết hợp với những thay đổi không đáng kể về nhiễu, dẫn đến việc tăng tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu trong tín hiệu thô (Hình 4).
Hình 4i. Mức tăng độ nhạy lý thuyết khi ghi MS2 như một hàm của khoảng m/z và giới hạn trên của khoảng khối thu thập bằng cách sử dụng Zeno trap.
Những cải tiến về độ nhạy MS2 này không chỉ có thể cải thiện đáng kể LOQ cho các phân tích định lượng mà còn có thể được sử dụng để cách mạng hóa toàn bộ quy trình làm việc. Với Zeno trap được kích hoạt, phổ MS2 chất lượng cao có thể được sử dụng để xác nhận, định danh hoặc đối chiếu thư viện mà chỉ cần lượng mẫu thấp hơn rất nhiều. Bằng cách pha loãng mẫu hơn nữa hoặc bơm trực tiếp ít mẫu hơn, mức tiêu thụ mẫu, các ảnh hưởng của nền mẫu có hại và sự nhiễm bẩn hệ thống MS cũng như hao mòn detector sẽ được giảm thiểu. Ở cùng lượng mẫu nạp lên hệ, ghi phổ MS2 với bẫy Zeno tăng cường hơn nữa độ tin cậy cho các tác vụ xác định đồng thời, tăng khả năng phát hiện các các chất chỉ thị metabolite, peptide và các chất gây ô nhiễm mới ở nồng độ thấp hơn rất nhiều
Hình 4ii. So sánh kết quả thu được giữa Zeno SWATH và SWATH thường, trong đó: B, số tiền chất xác định đượng trên 3 mẫu lặp trong các nền mẫu sinh học tại các lượng peptide đưa lên cột (3,9 – 2000 ng) so sánh giữa SWATH DIA (màu xanh dương) và Zeno SWATH DIA (màu cam); C, Phần trăm tăng thêm của các tiền chất và nhóm protein tăng thêm với Zeno SWATH so sánh với SWATH ở lượng mẫu lớn nhất (2000 ng).
Nghiên cứu từ Weiwen et al. liên quan tới phân tích thông lượng cao và ổn định protein trên các nền mẫu khỉ đuôi dài và người sử dụng Zeno SWATH thể hiện khả năng tăng cường chất lượng dữ liệu đáng kể kèm theo đó là số lượng các tiền chất và nhóm protein có thể phát hiện được mà không cần phải sử dụng tới nano LC hoặc micro LC [10]. Kết quả nghiên cứu thực hiện với hơn 1000 lần bơm mẫu cho 14,2 ngày ghi dữ liệu liên tục chỉ ra rằng Zeno SWATH mang lại lợi thế rõ rệt so với phương pháp SWATH DIA thông thường trên tất cả các loại mẫu được thử nghiệm, với độ nhạy cao hơn, độ ổn định định lượng tốt hơn, độ tuyến tính của tín hiệu được cải thiện và độ phủ protein tăng lên đến 9 lần. Sử dụng sắc ký với gradient 10 phút, có thể xác định tới 3300 protein trong mô với lượng peptit là 2 μg. Ở cùng lượng peptide được phân tích, Zeno SWATH đều thu được số lượng tiền chất vượt trội trên tất cả các nền mẫu (Hình 4ii B), kết quả này dẫn tới ở lượng peptit cao nhất 2000 ng với hầu hết các nền mẫu, Zeno SWATH cho phép thu được lượng tiền chất và nhóm protein tăng lên từ 40-50% so với SWATH (Hình 4ii C).
Zeno SWATH DIA
Với việc kết hợp Zeno trap vào hệ thống SCIEX QTOF, quy trình làm việc SWATH DIA được tăng cường hơn nữa. Zeno SWATH DIA kết hợp độ nhạy được kích hoạt bởi Zeno trap với khả năng tái tạo và độ chính xác của SWATH DIA. Zeno trap cung cấp những cải tiến về duty cycle giúp tăng cường độ nhạy ở mức MS2, cung cấp gấp 3 lần các protein được xác định và ~3-6 lần các protein có thể được định lượng, chỉ với lượng mẫu dưới 20 ng. Phổ MS2 chất lượng cao cho phép nhiều protein được xác định được và định lượng một cách đáng tin cậy với CV <20% [9].
Khi công nghệ MS tiếp tục được cải thiện, các thiết bị độ phân giải cao nhạy hơn và có khả năng hoạt động ở tốc độ quét nhanh hơn, do đó đẩy mảnh ranh giới độ bao phủ (pushing the boundaries of coverage depth) ngay cả với lượng mẫu nhỏ trong khi giúp giải quyết nhu cầu của quy trình omics (cả metabolomics và proteomics) thông lượng cao. Các phương pháp dựa trên LC gradient ngắn hơn yêu cầu duty cycle thấp hơn giúp đạt được sự cân bằng giữa số lượng các chất có thể định danh và độ chính xác của các phép đo. Khi thông lượng LC tăng lên, DIA thông thường phải đối mặt với thách thức hoặc giảm thời gian ghi MS/MS, làm giảm duty cycle hoặc tăng độ rộng cửa sổ khối của SWATH, làm giảm tính đặc hiệu. Mặc dù Zeno SWATH DIA thực sự là một kỹ thuật mạnh mẽ để định danh và định lượng protein, nhưng bản chất nó vẫn dựa trên SWATH và vẫn thiếu đi khả năng gán khối tiền chất với các phân mảnh tương ứng trong trường hợp phổ MS2 thu được rất phức tạp. Trong trường hợp gradient ngắn nhất, có những thách thức trong việc đạt được tính đặc hiệu trong khi vẫn duy trì đủ các điểm ghi tín hiệu cần thiết cho píc sắc ký để định lượng. Điều này tạo ra nhu cầu về một kỹ thuật DIA mới có thể chạy quét ở tốc độ cao hơn Zeno SWATH DIA mà không ảnh hưởng đến tính đặc hiệu.
Hình 5. Lợi ích của ZT Scan DIA và chiều Q1 bổ sung. (a) hình ảnh trực quan về chu kỳ Zeno SWATH DIA thông thường cho thấy dữ liệu được thu thập theo cách từng bước (mỗi ô chữ nhật thể hiện 1 lần ghi tín hiệu cho 1 khoảng cửa sổ khối phân lập cần ghi tín hiệu, chiều dọc thể hiện các khoảng khối phân lập Q1, chiều ngang thể hiện duty cycle của phương pháp, khoảng trống giữa các hình chữ nhật thể hiện thời gian cần để làm trống buồng va chạm), (b) trong cycle của ZT Scan, buồng va chạm không cần phải được làm trống, cho phép Q1 quét khoảng khối và bổ sung chiều thông tin này vào dữ liệu (thay vì các ô chữ nhật riêng lẻ như trong Zeno SWATH, cycle của ZT scan thể hiện là 1 dải liền mạch với 2 cận trên và dưới), (c) dữ liệu thô hiển thị một chu kỳ ZT Scan duy nhất được chọn (K562 200 ng, RT 12,14 phút, grad 15 phút), phần nằm giữa 2 đường gạch đứt thể hiện thông tin ghi được trong 1 cycle duy nhất mất 0,78 giây chứa tới 255 cửa sổ truyền khối MS2 với mỗi cửa sổ khối rộng 10 Da được trượt trên toàn khoảng khối Q1 (400-900 m/z), ở tốc độ quét 750 Da/giây với cửa sổ khối 10 Da, sẽ cần 1,33 ms để quét, và vì khoảng khối là 10, nên dwell time ghi MS2 của 1 số khối ở chiều Q1 sẽ là ~ 13,3 ms, (d) phổ XIC được trích xuất cho mỗi mảnh theo thời gian lưu, (e) Dữ liệu MS2 được thu thập từ các xung TOF được ghép (bin) theo m/z tiền chất chiều Q1 bổ sung, điều này cho phép phân biệt các mảnh chimeric (các mảnh được tạo ra trong quá trình phân tích MS/MS nhưng không đại diện cho cấu trúc chính của phân từ gốc) và các tiền chất và các mảnh thu được của chúng được căn chỉnh bằng chiều Q1, trong đó chiều Q1 trục hoành thể hiện dải m/z mà Q1 đang quét qua theo thời gian, các đường gạch nhỏ đại điện cho các xung TOF, dwell time là thời gian Q1 ở tại 1 m/z nhất định hay 1 bin để cho phép ion đi qua, bin size là kích thước của dải m/z mà Q1 đang quét qua tại 1 thời điểm nhất định (f) phân phối ion phân mảnh được hiển thị từ một thí nghiệm Zeno SWATH DIA và ZT Scan DIA được hiển thị trong c ở trên [6,7].
ZT Scan DIA
Việc phát triển kỹ thuật DIA mới được triển khai trên một bẫy Zeno sửa đổi cho mục đích nghiên cứu cho phép QTOF kết hợp các mức tăng độ nhạy và các cải tiến về duty cycle do bẫy Zeno cung cấp. Phương pháp ZT Scan DIA cung cấp hai lợi thế đáng kể so với các kỹ thuật DIA thông thường. Zeno SWATH DIA yêu cầu buồng va chạm phải được làm trống giữa các lần thu MS2 từ các cửa sổ khối DIA rời rạc, dẫn đến mất từ 1-2 ms cho mỗi sự kiện MS2 (Hình 5a). Khi tốc độ ghi tín hiệu tăng lên, khoảng thời gian này có thể làm giảm duty cycle (xuống dưới 80% ở 6,6 ms cho mỗi MS/MS). Ngược lại, phương pháp ZT Scan DIA không có giới hạn này, cho phép chu kỳ làm việc cao hơn ngay cả ở tốc độ ghi tín hiệu nhanh hơn. Thứ hai, trong DIA thông thường, các ion phân mảnh chỉ có thể được gán cho các tiền chất dựa trên thời gian lưu tương tự trong chiều rộng của cửa sổ phân lập Q1. Tuy nhiên, ZT Scan DIA vượt qua giới hạn này và cho phép liên kết tiền chất chính xác hơn. Điều này làm giảm nhiễu từ các chất phân tích đồng khối có cùng thời gian lưu, chất bẩn và nhiễu nền cao, có tác động đến việc định lượng các chất phân tích. ZT Scan DIA tối đa hóa độ chính xác và độ chụm định lượng bằng cách sử dụng tính chọn lọc của MS2 và chiều Q1 bổ sung. Khi kết hợp với tốc độ quét cao nhất và bẫy Zeno, độ phân giải và độ chính xác khối được bảo toàn để duy trì số lượng tối đa các chất phân tích được xác định và định lượng.
Trong mỗi chu kỳ (cycle), cửa sổ phân lập cho MS2 sẽ trượt dọc theo khoảng m/z mong muốn với tốc độ ghi MS/MS (sliding along the m/z range of interest at an MS/MS acquisition rate). Với SWATH DIA hoặc Zeno SWATH DIA giả sử để ghi tín hiệu MS/MS cho khoảng khối m/z 400-900 với mỗi cửa số khối không đổi là 10 Da, như vậy sẽ có 50 cửa số phân lập khối Q1 độc lập trải dài từ m/z 400-900 (ví dụ: cửa số khối 1 từ m/z 400-410, cửa số khối 2 từ m/z 410-420, tới cửa sổ khối 50 từ m/z 890-900). Tuy nhiên, trong ZT Scan DIA, các cửa sổ phân lập khối sẽ lần lượt là: cửa số khối 1 m/z 389-399, cửa số khối 2 m/z 390-400, cửa sổ khối 3 m/z 391-401, cho tới cửa sổ khối cuối cùng m/z 900-910. Như vậy với khoảng m/z 400-900 của phương pháp, sử dụng tốc độ quét 750 Da/giây với cửa sổ phân lập trượt 5 Da, sẽ tương đương với tốc độ ghi phổ là 640 Hz (640 phổ/giây). Các sự kiện ion được ghi lại ở mỗi xung TOF, khi cửa sổ phân lập quét qua khoảng khối (Hình 5b). Cơ chế quét DIA này không yêu cầu làm trống buồng va chạm, do đó rút ngắn cycle time. Mỗi phân mảnh có thể nhìn thấy khi cạnh đầu của Q1 truyền m/z tiền chất và biến mất khi cạnh phía sau của Q1 đi qua nó (Hình 5e). Ví dụ để ghi phổ phân mảnh của m/z 400, với cửa sổ phân lập khối Q1 đầu tiên bao gồm các m/z 389-399 bắt đầu quét, trong đó giá trị cạnh đầu của Q1 là 389 và giá trị cạnh sau của Q1 là 399. Tất cả các ion tiền chất có giá trị m/z nằm trong khoảng 389-399 bắt đầu được phân lập ở Q1 và ghi tín hiệu phân mảnh chưa bao gồm m/z 400 ở thời điểm t1. Việc này cũng đồng thời là các ion phân mảnh gắn với ion m/z 400 chưa thể xuất hiện trong phổ MS2. Sau đó cửa sổ bắt đầu trượt lên 1 đơn vị và bao gồm các m/z 390-400, ở thời điểm này tất cả các ion tiền chất có giá trị m/z nằm trong khoảng 390-400 sẽ được phân lập và ghi tín hiệu phân mảnh, tín hiệu MS2 của m/z 400 bắt dầu được ghi ở thời điểm t1, các ion phân mảnh mới xuất hiện trong khoảng thời gian t1 này có thể được gán cho ion m/z 400. Khoảng khối phân lập Q1 tiếp tục trượt cho tới khi bao gồm m/z 401-411 ở thời điểm t13, nghĩa là cạnh dưới của Q1 đã vượt qua giá trị m/z 400, khi đó các phân mảnh của ion m/z 400 không còn được ghi tín hiệu nữa và sẽ ko được thể hiện trong phổ ghi được. Do đó, các phân mảnh có thể được ánh xạ tới các tiền chất và mang đến một chiều bổ sung cùng với các chiều m/z, cường độ và RT (Hình 5d). Khoảng thời gian mà cửa số khối phân lập Q1 trượt qua giá trị m/z 400 bằng t13 – t1 chính là dwell time ghi phổ MS/MS của ion m/z 400. Ở tốc độ 750 Da/giây sẽ cần 1,33 ms để quét xong khoảng 10 Da và vì cửa sổ khối này sẽ cần trượt lên 10 lần mỗi lần 1 Da để cạnh dưới của nó đi qua giá trị m/z 400, nên dwell time sẽ là 1,33 ms x 10 = 13,33 ms (Hình 5c). Chiều Q1 này từ ZT scan DIA được sử dụng để phân biệt tín hiệu tiền chất với bất kỳ tín hiệu gây nhiễu nào tới từ một m/z của ion mảnh nội tại (internal fragment), các adduct hoặc việc mất khối xảy ra ở năng lượng va chạm thấp (Hình 5e). Dẫn đến cải thiện việc giải chập các chất phân tích phức tạp với mức độ đặc hiệu cao hơn (Hình 5f).
Hình 6. Số lượng các nhóm protein và tiền chất phát hiện và định lượng được trong 100 ng hỗn hợp 5-lysate sử dụng ZT Scan DIA (màu nâu nhạt) và Zeno SWATH DIA (màu xanh dương) trên hệ Waters M-Class LC và cột Phenomenex XB-C18 column (15 cm x 300 µm). (A) Tổng số nhóm protein phát hiện được, (B) Số nhóm protein phát hiện được với CV <20%, (C) Tổng số tiền chất phát hiện được, (D) Số tiền chất phát hiện được với CV <20%. 200 SPD (Samples Per Day) là phương pháp LC sử dụng gradient 1 phút (tổng thời gian chạy 7 phút) và 160 SPD là phương pháp LC sử dụng gradient 3 phút (tổng thời gian chạy 9 phút).
ZT Scan DIA cũng được so sánh với Zeno SWATH DIA để đánh giá về hiệu suất hoạt động trong các chiến lược phân tích thông lượng cao lên tới 500 mẫu/ngày (500 SPD) cho các mẫu tế bào người K562 và HEK 293, chuột, CHO, nấm men và ruồi giấm [11]. Kết quả từ nhóm nghiên cứu Yves et al. chỉ ra rằng với các chiến lược phân tích thông lượng cao lên tới 200 mẫu/ngày (200 SPD) và 160 mẫu/ngày (160 SPD), ZT Scan DIA đều cho kết quả vượt trội về tổng số lượng cũng như số lượng tiền chất cũng như số nhóm protein có thể phát hiện được với CV < 20% so với Zeno SWATH DIA, với hiệu suất tăng lên từ 20-30% (Hình 6). ZT Scan DIA chứng minh hiệu quả vượt trội ngay cả khi sử dụng gradient ngắn, nhờ khả năng đặc hiệu cao trong việc ánh xạ ion phân mảnh với ion tiền chất trong cửa sổ phân lập khối trượt. Ở thông lượng 200 SPD, phương pháp này xác định 2224 nhóm protein (1919 có CV <20%) và 9150 tiền chất (7737 có CV <20%), cho thấy ưu thế rõ ràng trong nghiên cứu proteomics có thông lượng cao.
Sự kết hợp giữa quét nhanh và độ nhạy này tối đa hóa tổng số phổ MS2 chất lượng cao được tạo cho mỗi chu kỳ. Điều này tạo ra dữ liệu mức PRM cho tất cả các ion trong một mẫu, tăng tính đặc hiệu và do đó, độ tin cậy về tổng số các chất phân tích được xác định và định lượng. Quét nhanh hơn cũng cho phép sử dụng thời gian chạy LC ngắn hơn, cải thiện đáng kể thông lượng và năng suất của phòng thí nghiệm. Điều này dẫn đến sự hiểu biết toàn diện hơn về những thay đổi sinh học cơ bản. Với ZT Scan DIA, thông tin tối đa được thu thập từ mỗi mẫu quý giá. Do đó, mỗi thí nghiệm TOF chứa nhiều thông tin MS2 hữu ích hơn, đặc biệt là cho các hợp chất có mức nồng độ thấp hơn mà trước đây không thể phát hiện được, mở ra cho các nhà nghiên cứu một mức độ nhạy và đặc hiệu mới.
Tài liệu tham khảo
