Đang tải...
Phân tích nhạy và chính xác các thuốc Z, chất chuyển hóa và hồ sơ phân hủy trong nước tiểu sử dụng LC-MS/MS
Matthew Standland1, Aaron Stella1 và Xiang He1
1SCIEX, Hoa Kỳ
Giới thiệu: Bài viết này tóm tắt và lược dịch nội dung trong ghi chú ứng dụng “Sensitive and accurate characterization of Z drugs, metabolites and their degradation profile in urine using LC-MS/MS, ”. Thêm vào đó cung cấp cho bạn đọc một số khái niệm cơ bản liên quan tới khối phổ thời gian bay (Time of Flight) khối phổ ba tứ cực (Triple Quad), và trình bày quan điểm của tác giả liên quan tới việc sàng lọc, phân tích nhạy và định danh tin cậy các chất liên quan trong nền mẫu nước tiểu. Về người dịch, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492
Tóm tắt: Ghi chú kỹ thuật này trình bày một phương pháp phân tích nhanh, mạnh mẽ và nhạy để phát hiện và định lượng các loại thuốc Z phổ biến cùng các chất chuyển hóa của chúng trong nước tiểu người. Thêm vào đó hồ sơ phân hủy (degradation profile) của chúng trong nhiều điều kiện khác nhau cũng đã được nghiên cứu sử dụng hệ thống SCIEX Triple Quad 5500+ - QTRAP® Ready và hệ thống SCIEX X500B QTOF. Sự kết hợp của hai hệ thống cho phép định lượng chính xác và nhạy các thuốc Z và chất chuyển hóa của chúng, đồng thời cung cấp khả năng xác định đáng tin cậy các sản phẩm phụ phân hủy.
Thuốc an thần gây ngủ không benzodiazepine, thường được gọi là "thuốc Z", là một loại thuốc an thần mới có cấu trúc khác với benzodiazepine nhưng có chung cơ chế tác dụng của thuốc. Thuốc Z thể hiện các lợi ích tương tự như tác dụng gây ngủ (hypnotic), an thần (sedative) và mất trí nhớ (amnesiac) thông qua sự điều biến dị lập thể dương (positive allosteric modulation - là cơ chế điều chỉnh hoạt động của protein, đặc biệt là các thụ thể, thông qua việc liên kết của một phân tử (gọi là chất điều biến dị lập thể) vào một vị trí khác với vị trí hoạt động (vị trí gắn chất chủ vận hoặc ligand) dẫn đến sự tăng cường đáp ứng của thụ thể khi chất chủ vận liên kết với vị trí hoạt động của nó) về dược lý của các tiểu đơn vị khác nhau trong thụ thể GABA (GABA receptor).1 Mặc dù tương tự như những tác dụng do benzodiazepine gây ra, nhưng sự tương tác độc đáo của chúng tại các tiểu đơn vị khác nhau dẫn đến các tác dụng khác nhau trong họ thuốc này.
Thuốc Z chủ yếu được chỉ định để điều trị chứng mất ngủ ngắn hạn. Ngoài tác dụng gây ngủ, loại thuốc này còn có những rủi ro tiềm ẩn và tác dụng phụ như buồn nôn, buồn ngủ, chóng mặt, ảnh hưởng sự tỉnh táo và trong những trường hợp nghiêm trọng, có thể gây hôn mê và suy hô hấp. Tỷ lệ cao của các trường hợp nghiêm trọng, thậm chí dẫn đến tử vong liên quan tới thuốc Z, đã thúc đẩy FDA áp đặt các yêu cầu ghi nhãn nghiêm ngặt hơn.2 Việc phân tích nhanh sự chuyển hóa và bài tiết của thuốc Z là rất quan trọng do tác dụng phụ thường xảy ra nhanh. Do đó, khả năng nhanh chóng xác định và định lượng các thuốc Z thường được kê đơn và chất chuyển hóa của chúng trong nền sinh học là vô cùng quan trọng, đặc biệt là trong trường hợp ngộ độc thuốc hoặc hành vi tội phạm có liên quan tới thuốc.
Các đặc điểm chính của phương pháp LC-MS/MS để phân tích chính xác thuốc Z trong nước tiểu được trình bày trong ghi chú kỹ thuật này bao gồm:
2.1. Hoá chất và chất chuẩn
Năm loại thuốc Z và 4 chất nội chuẩn tương ứng được mua từ Cerilliant. Hỗn hợp dung dịch chuẩn thuốc Z (10 µg/mL) và hỗn hợp các chất nội chuẩn deuteri (1 µg/mL) được chuẩn bị trong MeOH. Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20°C. Hình 1 thể hiện sự đa dạng về cấu trúc giữa các thuốc Z bao gồm 3 trong số 5 thuốc Z có trong phương pháp này (zolpidem, zopiclone và zaleplon). Danh sách 5 loại thuốc Z được sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp trong Bảng 1. Hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc (10 µg/mL) được sử dụng để chuẩn bị dãy 11 dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 - 2000 ng/mL bằng cách thêm các lượng phù hợp dung dịch chuẩn gốc 10 µg/mL vào 100 µL mẫu trắng nước tiểu để đạt đến mức nồng độ mong muốn sau đó thêm hỗn hợp chất nội chuẩn 1 µg/mL.
2.2. Chuẩn bị mẫu
Các dung dịch đã thêm chuẩn được pha loãng 10 lần bằng cách pha loãng 100 µL mẫu trong MeOH 10% và axit formic 0,1% trong nước đến thể tích cuối cùng là 1 mL. Các mẫu thu được sau đó được giữ trong lọ HPLC và đặt vào bộ lấy mẫu tự động giữ ở 8 ºC.
2.3. Phương pháp LC-MS/MS và LC-HRMS
Việc tách sắc ký được thực hiện trên Hệ thống ExionLC™ với cột Phenomenex Phenyl-Hexyl (50 × 4,6 mm, 2,6 µm, 00B-4495-E0) ở 45ºC. Pha động được sử dụng bao gồm amoni format, MeOH và các chất phụ gia thích hợp. Thể tích bơm mẫu lên cột là 5 µL. Tổng thời gian chạy LC là 6 phút trên hệ SCIEX 5500+ và 12 phút với hệ SCIEX X500B QTOF. Dữ liệu được thu thập bằng hai thiết bị khác nhau, trong đó hệ SCIEX 5500+ để phân tích định lượng và hệ SCIEX X500B QTOF để xác định tin cậy các sản phẩm phân hủy của thuốc Z và chất chuyển hóa trong nước tiểu. Cả hai thiết bị đều sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) ở chế độ dương. Thuật toán MRM đã được sử dụng trên Hệ thống SCIEX 5500+ với phần mềm Analyst®. Dữ liệu MS và MS/MS được thu thập trên Hệ thống SCIEX X500B QTOF sử dụng kỹ thuật ghi dữ liệu phụ thuộc (IDA – Information Dependent Acquisition hoặc DDA – Data Dependent Acquisition) trong đó tối đa 10 ion với ngưỡng cường độ tối thiểu là 500 cps được tự động chọn để kích hoạt ghi tín hiệu IDA.
2.4. Phân tích dữ liệu
Việc xử lý dữ liệu được thực hiện bằng Phần mềm SCIEX OS. Phân tích định lượng được thực hiện trong mô-đun Analytics của phần mềm, các đường chuẩn, tính toán nồng độ, độ chuẩn xác và độ chính xác của thử nghiệm được tạo tự động. Việc xác định chất phân tích dương tính thông qua đối chiếu thư viện phổ MS/MS được thực hiện bằng bốn tiêu chí độ tin cậy chính: sai số về số khối chính xác (M), thời gian lưu (R), chênh lệch tỷ lệ đồng vị (I) và điểm tham chiếu thư viện (L).
Hình 1. Sự đa dạng về cấu trúc giữa các thuốc Z, cùng với cấu trúc lõi. Cấu trúc hóa học đại diện của 6 thuốc Z, ba trong số đó (zolpidem, zopiclone và zaleplon) được phân tích trong ghi chú kỹ thuật này
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Hiệu suất định lượng của phương pháp sử dụng hệ SCIEX 5500+
Các mẫu nước tiểu đối chứng được thêm chuẩn và hỗn hợp chất nội chuẩn, được chuẩn bị bằng quy trình chuẩn bị mẫu pha loãng và đo trực tiếp. Mỗi mẫu được đo lặp 3 lần để xây dựng phương pháp xử lý phân tích dữ liệu. Hình 2 thể hiện phổ XIC của 5 thuốc Z và 4 chất nội chuẩn tương ứng, hầu hết các chất phân tích được tách gần như hoàn toàn với tổng thời gian 5 phút.
Hình 2. Phổ XIC của 5 thuốc Z (và 4 chất chuẩn nội) trong nghiên cứu này. Các píc được đánh số lần lượt là: 1) zolpidem-phenyl-4 axit cacboxylic, 2) N-desmethyl zopiclone và nội chuẩn, 3) zopiclone và nội chuẩn, 4) zolpidem và nội chuẩn, và 5) zaleplon và nội chuẩn.
Hiệu suất định lượng của phương pháp đã được nghiên cứu bằng cách bơm các mẫu chuẩn được thêm chuẩn với các nồng độ trong khoảng từ 1 đến 2000 ng/mL trên nền nước tiểu tổng hợp trắng. Đường chuẩn 9 điểm được sử dụng đánh giá độ nhạy và độ tuyến tính của phương pháp. Hình 3 thể hiện các đường hồi quy cho từng thuốc Z với độ tuyến tính tốt trên toàn bộ đường chuẩn, với các giá trị R2 lớn hơn 0,99.
Hình 3. Độ tuyến tính rất tốt cho 5 thuốc Z với nồng độ từ 1 đến 2000 ng/mL.
Bảng 1 thể hiện độ chính xác của phép đo ở ba mức nồng độ thêm chuẩn thấp nhất (1, 2,5 và 5 ng/mL) cho 5 thuốc Z trong nghiên cứu này. Các kết quả thu được cho thấy hiệu suất định lượng và độ tin cậy cao của phương pháp. Trong đó, các giá trị %CV (độ chụm - precision) dao động từ 0,75 - 11,65%, thể hiện sự ổn định cao của phương pháp ở khoảng dưới của khoảng nồng độ đường chuẩn. Độ chính xác cho các mẫu nước tiểu đã thêm chuẩn dao động từ 80 - 100% (dữ liệu không công bố).
Bảng 1. Độ chụm của các thuốc Z ở các mức nồng độ thấp (n = 3)
3.2. Phân tích hồ sơ phân hủy của thuốc Z
Nước tiểu là một nền mẫu sinh học phổ biến được sử dụng để phát hiện thuốc Z và là nền mẫu được ưa chuộng trong các trường hợp liên quan tới án, thêm vào đó khoảng thời gian phát hiện của nền mẫu này tương đối dài hơn các nền khác (ví dụ: máu hoặc huyết tương).3 Do sự khởi phát và chuyển hóa của các thuốc này tương đối nhanh, nên khả năng định lượng nhanh chóng và chính xác thuốc Z cùng các chất chuyển hóa của chúng trước khi xảy ra sự phân hủy là vô cùng quan trọng.4 Trong 5 loại thuốc Z được nghiên cứu, zopiclone được báo cáo là có sự phân hủy nhanh trong nền nước tiểu, ngay cả khi được bảo quản trong tủ lạnh.5, 6 Zopiclone cũng được báo cáo là đặc biệt dễ bị phân hủy trong môi trường kiềm, dẫn đến sự chuyển hóa thành 2-amino-5-chloropyridine (ACP).4
Hồ sơ phân hủy của zopiclone đã được nghiên cứu trong các điều kiện khác nhau theo thời gian và được phân tích trên cả hệ SCIEX 5500+ và SCIEX X500B QTOF. Zopiclone được thêm chuẩn vào mẫu trắng nước tiểu tổng hợp và được thử nghiệm với năm điều kiện dung môi khác nhau trong 840 phút ở 8 ºC. Hình 4 cho thấy hồ sơ phân hủy của zopiclone theo thời gian ở 5 điều kiện thử nghiệm, đồ thị thể hiện diện tích píc của zopiclone theo thời gian. Zopiclone bị phân huỷ trong các điều kiện trung tính và kiềm yếu (methanol 10%, methanol 10% với amoni bicacbonat 0,1%, pH 7,5 và methanol 10% với amoni hydroxit 0,1%). Tuy nhiên, zopiclone ổn định hơn trong các điều kiện axit (methanol 10% với axit formic 0,1% và methanol 10% với axit axetic 0,1%). Do đó, sự phân huỷ zopiclone có thể được giảm bớt bằng cách thêm axit trong các dung môi chuẩn bị mẫu.
Hình 4. Hồ sơ phân hủy zopiclone trong các điều kiện dung môi khác nhau. Zopiclone được thêm vào nước tiểu tổng hợp đã được thử nghiệm trong năm điều kiện dung môi khác nhau (methanol 10%, methanol 10% với axit formic 0,1%, methanol 10% với axit axetic 0,1%, methanol 10% với amoni bicacbonat 0,1% PH 7,5 và methanol 10% với amoni hydroxit 0,1%) và diện tích píc được theo dõi theo thời gian.
Hồ sơ phân hủy của zopiclone và sự chuyển hóa thành ACP đã được nghiên cứu thêm với hệ SCIEX X500B QTOF. Hình 5 cho thấy phổ XIC, gồm TOF MS và TOF MS/MS của ACP trong mẫu nước tiểu tổng hợp chứa 1 ng/mL zopiclone ở điều kiện kiềm. Kỹ thuật IDA trên hệ X500 cho phép ghi được phổ MS/MS toàn diện với chất lượng cao, từ đó cho phép xác định chính xác và đáng tin cậy ACP là sản phẩm phụ phân hủy của zopiclone trong nước tiểu bằng cách đối chiếu phổ thư viện. Phần mềm SCIEX OS cho phép xác định chính xác và tin cậy ACP sau khi đánh giá các thông tin liên quan tới sai số về số khối chính xác (-1,6 ppm), thời gian lưu của chất chuẩn ACP (3,95 phút), phân bố đồng vị và điểm tham chiếu thư viện phổ MS/MS.
Hình 5. Kết quả thu được từ kỹ thuật ghi tín hiệu IDA cho phép xác định chính xác và tin cậy APC, một trong những sản phẩm phụ phân hủy chính của zopiclone.
4. Kết luận
Trong ghi chú kỹ thuật này, phương pháp nhạy và mạnh mẽ và đơn giản đã được phát triển để định lượng và xác định chính xác 5 thuốc Z và chất chuyển hóa trong nước tiểu người. Hiệu suất định lượng của phương pháp đã được nghiên cứu trên hệ SCIEX 5500+. Các kết qủa thu được thể hiện độ tuyến tính, độ chụm và độ chính xác cao cho khoảng nồng độ từ 1 đến 2000 ng/mL. Hồ sơ phân hủy của một trong các thuốc Z, zopiclone, được nghiên cứu trên hệ SCIEX X500B QTOF. Kết quả cho thấy zopiclone dễ bị phân hủy trong điều kiện trung tính và kiềm yếu. Sử dụng chế độ IDA để thu thập dữ liệu và các tiêu chí về độ tin cậy cho phép xác định chính xác ACP, một trong những sản phẩm phân hủy của zopiclone trong nước tiểu. Nhìn chung, các kết quả cho thấy rằng việc sử dụng kết hợp hệ thống SCIEX 5500+ và hệ SCIEX X500B QTOF cho phép phân tích định tính và định lượng đầy đủ các thuốc Z, chất chuyển hóa và các sản phẩm phân hủy với độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chụm và độ chính xác cao.
5. Tài liệu tham khảo
