HIỆN TƯỢNG PHOTOBLEACHING (TẨY MÀU HUỲNH QUANG) VÀ CÁCH KHẮC PHỤC

Tẩy màu huỳnh quang (Photobleaching) là một quá trình trong đó fluorophores mất khả năng phát huỳnh quang hiệu quả, dẫn đến mờ dần tín hiệu huỳnh quang gây ra bởi chiếu sáng mẫu trong thời gian dài hoặc với cường độ mạnh. Sự thay đổi quang hóa này thường là kết quả của sự phá vỡ liên kết cộng hóa trị và sắp xếp lại trong cùng một phân tử hoặc với các phân tử lân cận. Cuối cùng, điều này phá hủy các đặc tính fluorogen của phân tử và dẫn đến sự giảm độ rõ của hình ảnh liên tục theo thời gian Nếu tín hiệu huỳnh quang thấp, điều này có thể dẫn đến kết quả âm tính giả và dữ liệu sai lệch. Do đó, các phương pháp khác nhau đã được đề xuất để giảm photobleaching.

Hình 1: Các tế bào HeLa đã được cố định và gắn phalloidin liên hợp FITC. Hình (A) hiển thị cường độ ban đầu của fluorophore, trong khi hình (B) hiển thị quá trình photobleaching xảy ra sau 36 giây chiếu sáng liên tục.

Sử dụng thuốc nhuộm khác

Một số thuốc nhuộm huỳnh quang dễ bị tẩy hơn các loại khác. Do đó, bằng cách sử dụng thuốc nhuộm khác với hàng ngàn chu kì kích thích/phát xạ mà không bị tẩy trắng. Ví dụ thuốc nhuộm xanh lá cây sẽ bền hơn thuốc nhuộm đỏ.

Hình 2: một ví dụ điển hình về photobleaching được quan sát thấy ở các thời điểm khác nhau trên một phần mỏng của bộ phận bảo quản lạnh (16 micromet) của ruột chuột. Các hạt nhân được nhuộm bằng Sytox Green (huỳnh quang màu xanh lá cây), trong khi chất nhầy của các tế bào được nhuộm bằng Alexa Fluor 350 agglutinin (huỳnh quang màu xanh da trời) và Actin dạng sợi ở viền nhuộm bằng Alexa Fluor 568 phalloidin (huỳnh quang màu đỏ). Các điểm thời gian được thực hiện trong khoảng thời gian hai phút. Ban đầu cả ba fluorophores đều có cường độ tương đối cao trong Hình 1 (a), nhưng cường độ Alexa Fluor 350 và 568 (xanh da trời và đỏ) bắt đầu giảm nhanh sau hai phút và gần như biến mất hoàn toàn sau sáu phút. Nhân nhuộm màu xanh lá cây có khả năng chống photobleaching nhiều hơn, nhưng cường độ của chúng cũng giảm dần trong suốt chuỗi thời gian (10 phút).

Giảm ánh sáng

Quá trình tẩy trắng có thể được giảm bằng cách sử dụng nguồn sáng có ít photon hơn và giảm cường độ chiếu sáng. Tuy nhiên, giảm cường độ ánh sáng cũng có thể làm giảm cường độ tín hiệu. Do đó, cần phải cân bằng chính xác giữa việc đạt được cường độ tín hiệu phù hợp và quá trình photobleaching tối thiểu.

Có nhiều loại nguồn ánh sáng huỳnh quang bao gồm thủy ngân, đèn hồ quang xenon và đèn LED. Các đèn thủy ngân và xenon hồ quang truyền thống cung cấp các bước sóng ánh sáng rất mạnh, dẫn đến hiện tượng quang hóa cao và gây tổn hại tế bào. Các ứng dụng hiện đại thường sử dụng đèn LED có thể được điều khiển linh hoạt và có thể giảm bớt quá trình photobleaching.

Giảm thời gian chiếu sáng

Chiếu sáng liên tục trong thời gian dài là nguyên nhân dẫn đến tẩy trắng màu. Bạn chỉ nên bật đèn huỳnh quang trong lúc cần phân tích mẫu, sau đó không cần thiết nên tắt đi để tránh ảnh hưởng mẫu. Tuy nhiên việc này sẽ khả thi hơn khi bạn dùng ánh sáng LED có thể dễ dàng bật/tắt chứ không như các đèn thủy ngân truyền thống. Cường độ sẽ nhanh chóng đạt được mức mong muốn mà không tốn nhiều thời gian làm nóng/lạnh hệ thống.

Bạn cũng có thể lấy tìm khu vực quan tâm và lấy nét mẫu bằng sử dụng đường sáng truyền qua trước khi chuyển sang chiếu sáng huỳnh quang.

Bổ sung chất chống phai màu (antifade)

Antifades là thuốc thử thương mại có thể làm giảm hiệu ứng phản ứng ánh sáng. Đây là các mounting media, được sử dụng sau tất cả các bước của hóa mô miễn dịch ở bước cuối cùng trước khi chụp ảnh.

Các thuốc chống phai màu khác nhau có sẵn có thể được kiểm tra để xem chúng có tác dụng tối ưu cho mẫu của bạn.

Lan Phương