Phân tích Định tính và Định lượng β-caroten bằng UPC 2

LỢI ÍCH ỨNG DỤNG

■ Phương pháp UPC 2 ™ nhanh chóng để tách ba carotenoid phổ biến nhât giúp giảm thiểu nguy cơ biến đổi chất

■ Phương pháp UPC 2 nhanh hơn bốn lần so vớicác phương pháp phân tích truyền thống, do đó, giảm tiêu thụ dung môi hữu cơ 85%.

■ Đối với phân tích được kiểm tra, chiết xuất β-caroten trong MTBE có thể được tiêm trực tiếp vào hệ thống ACQUITY UPC 2 ™ để phân tích không cần tốn thời gian tại các bước bay hơi và hoàn nguyên.

GIẢI PHÁP WATERS

Hệ thống: ACQUITY UPC 2 với detector (PDA)

Phần mềm: MassLynx ®

Cột: ACQUITY UPC ² HSS C ₁₈ SB

KEY WORDS

Carotenoid, lutein, β-caroten, lycopene, tan trong chất béo, vitamin,

sắc ký hội tụ, UPC ²

GIỚI THIỆU

Carotenoid là các sắc tố tự nhiên được tổng hợp bởi thực vật và một số  vi sinh vật. Đối với động vật và con người carotenoid giúp nâng cao thị lực. Carotenoid cũng hoạt động như chất chống oxy hóa quan trọng với tác dụng ngăn ngừa

hiệu quả cho các bệnh khác nhau. Vì không thể tổng hợp carotenoids de novo

trong cơ thể con người, con người cần thu nhận chúng thông qua chế độ ăn uống và thực phẩm bổ sung.

Trong năm 2010, giá trị thị trường của các carotenoid được sử dụng thương mại được ước tính là 1,2 tỷ đô la và dự kiến ​​sẽ tăng lên 1,4 tỷ đô la vào năm 2018. Như vậy,  cần tuân thủ nghiêm ngặt quy định của luật pháp về vi chất dinh dưỡng trong thực phẩm tăng cường các sản phẩm và thực phẩm chức năng đang được ban hành hoặc dự kiến, vơi nhu cầu ngày càng tăng về phương pháp phân tich nhanh chóng và đang tin cậy để phân tích , định lượng hàm lượng carotenoid trong nhiều loại thực phẩm. Tốc độ phân tích có tầm quan trọng đặc biệt vì giám sát tuân thủ quy định  thường yêu cầu một số lượng lớn các thử nghiệm. Ngoài ra, nhiều carotenoid có tính nhiệt bền nhiệt kém- hoặc nhạy cảm rất dễ bị đồng phân hóa và phân hủy hóa học. Thời gian phân tích kéo dài có thể dẫn đến kết quả định lượng không chính xác.

Hình 1. Cấu trúc hóa học và giá trị LogP của ba loại carotenoid được sử dụng trong nghiên cứu này.

Phần trung tâm của cấu trúc carotenoid là chuỗi polyene dài xen kẽ các liên kết đôi và các liên kết đơn, như thể hiện trong Hình 1. Do đó, carotenoid thường có tính kỵ nước cao, đặc biệt là những chất không chứa bất kỳ nguyên tử dị thể nào, chẳng hạn như lycopene và β-carotene. Kỹ thuật Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các máy dò độ hấp thụ khác nhau là là kỹ thuật phân tích thường được sử dụng để xác định chất lượng và định lượng carotenoid. Do tính kỵ nước cao, sự phân tách của carotenoid bằng RPLC thường dẫn đến thời gian phân tích kéo dài. Hơn nữa, tất cả các phương pháp dựa trên RPLC thường chịu sự hòa tan thấp của các carotenoid trong pha động. LC pha đảo không chứa nước (NARP) đã được sử dụng

để giảm thời gian chạy bằng cách sử dụng các pha động bán nước hoặc không chứa nước. Tuy nhiên, phương pháp NARP thường liên quan đến việc sử dụng các hỗn hợp dung môi hữu cơ phức tạp làm pha động.  Ví dụ, trong phương pháp AOAC chính thức đối với β-caroten trong chất bổ sung và nguyên liệu thô, hỗn hợp butyl hóa hydroxytoluene (BHT), isopropanol, N -ethyldiisopropylamine, amonium axetat, axetonitril, và metanol được sử dụng làm pha động.

Sự phân tách các carotenoid từ lâu đã trở thành chủ đề của sắc ký lỏng siêu tới hạn

sắc ký (SFC) nghiên cứu kể từ khi thành lập. Thành phần chính của pha động trong SFC, là CO₂ , cung cấp khả năng hòa tan vượt trội cho các carotenoid và thúc đẩy tương tác không phân cực giữa các carotenoid và pha động, do đó làm giảm thời gian lưu. Ngoài hiệu quả sắc ký cao được tạo ra bởi sự khuếch tán cao của CO ₂ , sử dụng nhiệt độ vừa phải trong SFC có lợi, do tránh sự phân hủy nhiệt của các carotenoid.

Sắc ký hội tụ UltraPerformance ™ (UPC ²) là một danh mục mới của khoa học sắc ký kết hợp thành công của cả SFC và UPLC. Trong khi vẫn giữ  các nguyên tắc cơ bản của SFC, UPC ² thúc đẩy giảm thể tích của hệ thống UPLC, và quan trọng

hơn, khả năng phân tách đặc biệt của hạt nhồi kích thước  nhỏ 2 µm, do đó, dẫn đến thời gian chạy giảm đáng kể, độ phân giải được cải thiện và tăng độ nhạy phát hiện.

Trong ghi chú ứng dụng này, chúng tôi mô tả sự phân tách nhanh chóng của ba loại carotenoid phổ biến bằng UPC ² trong vòng chưa đầy 2 phút. Một phân tích định lượng của viên nang bổ sung β-carotene  cũng được chứng minh.

THỰC NGHIỆM

Điều kiện UPC ²

Hệ thống: ACQUITY UPC 2

Detector: Máy dò PDA

Lưu lượng dòng chảy: 1,5 mL / phút

Pha động A: CO ₂

Pha động B: Ethanol

Cột:   ACQUITY UPC 2 BEH,

CSH ™ Fluoro-Phenyl,

BEH 2-EP (3,0 x 100 mm, 1,7 μm),

và HSS C 18 SB (3,0 x 100 mm, 1,8 µm)

Áp lực đẩy: 2190 psi

Nhiệt độ SM: 5 ° C

Nhiệt độ: 40 ° C

Chất pha loãng mẫu: MTBE

Dung tích thuốc tiêm: 1 µL

Vials:  Waters ® Amber Glass

         12 x 32 mm Screw neck

         vial, 2 mL

Phạm vi quét PDA: 220 đến 600 nm

Quản lý dữ liệu: Phần mềm MassLynx

Chương trình Gradient :

Thời gian (phút)

THỰC NGHIỆM

Điều kiện UPC 2 được tối ưu hóa cho phân tích dịch chiết β-caroten

Lưu lượng dòng chảy: 1,5 mL / phút

Pha động: 75:25 CO ₂ / etanol - isocratic

Cột: ACQUITY UPC ² HSS C ₁₈ SB 3.0 x 100 mm, 1,8 µm

Áp lực đẩy:  2190 psi

Nhiệt độ SM: 5 ° C

Nhiệt độ: 40 ° C

Chất pha loãng mẫu: MTBE

Dung tích thuốc tiêm: 1 µL

Vials: Waters Amber Glass

         12 x 32 mm Screw Neck

         Vials, 2 mL

Phạm vi quét PDA: 350 đến 600 nm

Bước sóng:  440 nm với một bước sóng tham chiếu 550-600nm

Mô tả mẫu

Tất cả việc chuẩn bị mẫu được thực hiện trong môi trường có ánh sáng dịu.

Để sàng lọc cột và tối ưu hóa tiếp theo, 1 mg mỗi lycopene, β-caroten, và lutein được hòa tan trong 10 mL metyl tert-butyl ete (MTBE) để tạo dung dịch gốc 0,1 mg / mL.

Đường cong hiệu chuẩn: Độ pha loãng nối tiếp của dung dịch gốc β-caroten (0,1 mg / mL trong MTBE) đã được thực hiện. Diện tích đỉnh trung bình của ba lần tiêm lặp lại ở mỗi nồng độ đã được sử dụng cho mỗi điểm dữ liệu.

Phân tích viên nang: Ba viên nang β-carotene với hàm lượng ghi  trên nhãn

15 mg / viên nang được chuẩn bị bằng cách cắt chúng ra và hòa tan các chất bên trong trong 250 mL MTBE . Đối với mỗi thử nghiệm, lặp lại 6 lần tiêm được thực hiện và diện tích peak trung bình được sử dụng  để tính hàm lượng β-caroten trong viên nang.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Lutein, lycopene và β-carotene là ba loại carotenoid phổ biến nhất được tìm thấy trong chế độ ăn uống ở Bắc Mỹ. Sàng lọc sơ bộ cho thấy methanol ở dạng pha động B (đồng dung môi) dẫn đến hình dạng peak kém, do độ hoà tan carotenoid trong metanol thấp, trong khi isopropanol như một đồng dung môi dẫn đến

các đỉnh rộng hơn. Do đó, etanol được chọn làm đồng dung môi trong tất cả các thí nghiệm. Hình 2 cho thấy, sắc ký đồ UPC ² / UV của hồn hợp carotenoid từ sàng lọc cột. Danh tính peak đã được xác nhận bằng cách tiêm chất chuẩn riêng biệt sử dụng cùng một điều kiện. Trong khi Cột ACQUITY UPC ² C ₁₈ SB cho độ phân giải cơ bản của cả ba carotenoid, một cột tương đối không phân cực khác, CSH Fluoro-Phenyl, cũng cung cấp sự phân tách một phần giữa lycopene và β-carotene. Không có sự phân tách giữa lycopene và β-caroten được quan sát trên cột BEH hoặc BEH 2-Ethyl Pyridine. Mặc dù có sự tương đồng về cấu trúc và tính phân cực giữa lycopene và β-carotene, các chuỗi carbon octadecyl trên cột ACQUITY UPC 2 C 18 SB cung cấp đủ độ phân giải để phân biệt hai chất phân tích trong UPC ² .

Hình 2. UPC 2 / Sắc ký đồ UV của hỗn hợp lycopene, β-carotene và lutein sử dụng các cột khác nhau sau: (A) HSS C 18 SB, (B) CSH Fluoro-Phenyl, (C) BEH 2-EP, và (D) BEH. Đặc điểm nhận dạng của các pic như sau: 1. Lycopene, 2. β-carotene, và 3. Lutein.

Hình 3. Sắc ký đồ UPC ² / UV thu được khi sử dụng Cột ACQUITY UPC 2 HSS C 18 SB trong các điều kiện gradient / isocrate khác nhau bao gồm: (A) điều kiện sàng lọc ban đầu: 5% đến 20% trong 5 phút, (B) 20% đến 30% trong 0,5 phút, và (C) 25% đẳng cấp. Danh tính của các peak là: 1. Lycopene, 2. β-carotene, và 3. Lutein.

Tiếp theo, một bước tối ưu hóa đã được thực hiện để rút ngắn thời gian chạy. Đường cong gradient của 20% B / phút, được hiển thị trong hình 3B và chương trình isocratic ở 25% B, như trong Hình 3C, cả hai đều cung cấp độ phân giải đủ cho cả ba carotenoid với thời gian chạy dưới 2 phút. Peak rửa giải muộn (lutein) từ phương pháp isocratic có chiều rộng peak rộng hơn một chút so với phương pháp gradient, nhưng phương pháp isocratic tạo ra một đường cơ sở có thể có lợi cho việc phát hiện mức độ thấp. Do đó, phương pháp isocratic được chọn để phân tích định lượng. Phương phap tối ưu hoá nhanh hơn 4 lần so với phương pháp định lượng truyền thống. Kéo theo đó, Kết quả là, tiêu thụ dung môi hữu cơ đã giảm khoảng 85%. Cũng cần lưu ý rằng đối với SFC sử dụng cột C18, sự lưu giữ các chất phân tích không phân cực, như carotenoid, giảm theo độ hoà tan của chất phân tích trong pha động. Vì sử dụng CO₂ nén nên cung cấp khả năng hòa tan vượt trội cho các chất phân tích không phân cực, nên UPC ² vốn có nhiều tương thích hơn và phân tích carotenoid nhanh hơn RPLC

Hình 4. Sắc ký đồ UPC 2 của (A) β-caroten chuẩn, (B) chiết xuất β-caroten từ viên nang, và (C) hỗn hợp ba carotenoid trong điều kiện sắc ký tối ưu.

Để định lượng, hàm lượng β-caroten của công thức viên nang bán sẵn trên thị trường được hòa tan trong MTBE, và dịch chiết đươc tiêm trực tiếp vào hệ thống ACQUITY UPC 2 để phân tích bằng cách sử dụng phương pháp tối ưu, thể hiện trong Hình 3C. Sắc ký đồ đại diện của dịch chiết β-caroten thu được được hiển thị trong Hình 4B. Việc chuẩn bị mẫu đơn giản thể hiện một ưu điểm khác của việc sử dụng UPC 2 cho chất phân tích mẫu có độ phân cực thấp. Hoà tan các mẫu phân cực thấp thường yêu cầu sử dụng dung môi phân cực thâp, ví dụ như MTBE và hexan, vốn tương thích với UPC 2. Ngược lại, RPLC yêu cầu các mẫu phải được hoá tan trong các dung môi hữu cơ phân cực thấp, được làm bay hơi và hoàn nguyên thành dung dịch pha loãng thích hợp trước khi phân tích.

Hình 5 cho thấy đường chuẩn cho β-caroten trong MTBE với nồng độ từ 0,0001 đến 0,1 mg / mL. Phạm vi tuyến tính trải dài ba bậc độ lớn với R ² > 0,99. Giới hạn phát hiện (LOD, được định nghĩa là S/N >3) và giới hạn định lượng (LOQ, được định nghĩa là S/N >10) là 50 và 100 ng/ml, tương ứng. Những giá trị nay tương đương hoặc tốt hơn những giá trị được báo cao bằng HPLC. Độ nhạy phát hiện cao co thể một phần là do sự tương thích vốn có giữa phân tích caroten và UPC 2. Sự tương tác không phân cực giữa CO2 và β-caroten làm giảm đáng kể sự lưu giữ của nó, do đó dẫn đến việc rửa giải sớm để cải thiện độ nhạy,

Hình 5. Đường chuẩn cho β-caroten trong MTBE với nồng độ khoảng 0,0001 đến 0,1 mg / mL trong MTBE.

Bảng 1 và 2 tóm tắt các phân tích viên nang β-caroten. Khả năng tái lập tuyệt vời  giữa và trong quá trình xét nghiệm trong cả thời gian lưu và diện tích đỉnh đã đạt được. Các xét nghiệm tổng thể cũng mang lại độ chính xác tốt so với nhãn yêu cầu. Việc chuẩn bị mẫu rất đơn giản và dễ hiểu, chất phân tích sắc ký sử dụng UPC 2 nhanh chóng và lặp lại.

Bảng 1. Độ tái lập của thử nghiệm viên nang β-caroten với sáu lần tiêm lặp lại.

Bảng 2. Định lượng β-caroten trong ba viên nang.

KẾT LUẬN

Tóm lại, phương pháp UPC 2 đã được phát triển thành công để tách ba loại carotenoid phổ biến nhất với thời gian phân tích chưa đầy hai phút. Phương pháp này nhanh hơn 4 lần so với các phương pháp phân tích truyền thống, do đó giảm tiêu thụ dung môi hữu cơ đên 85%. Thời gian phân tích cũng giảm thiều nguy cơ xuống cấp trên cột chất phân tích. Tốc độ phân tích được cải thiện là do khả năng tương thích vốn có giũa UPC 2 và các chất phân tích có độ phân cực thấp. Phương pháp UPC 2 sử dụng etanol làm đồng dung môi thay vì hỗn hợp của các dung môi hữu cơ thường được sử dụng trong các phương pháp HPLC. Do đó, UPC 2

là một phương pháp thân thiện với môi trường hơn.

Mục tiêu đã được phát triển cho phương pháp định lượng β-caroten trong viên nang thực phẩm chức năng bằng phương pháp UPC 2 kéo dài 1,5 phút. Phạm vi động, với LOD và LOQ tương ứng là 50 ng / mL và 100 ng / mL. Sử dụng MTBE làm dung môi chiết xuất, tạo ra dịch chiết β-caroten có thể được tiêm trực tiếp vào Hệ thống ACQUITY UPC 2 để phân tích mà không cần mất thời gian làm bay hơi mất dung môi và các bước hoàn nguyên thường được kết hợp với RPLC dựa trên methodology. Khả năng tái tạo tuyệt vời và độ chính xác cao chứng minh cho phân tích viên nang bổ sung chế độ ăn uống. Thông lượng phương pháp UPC 2 cao phù hợp với lý tưởng cho các phòng thí nghiệm thông thường thực hiện kiểm soat chất lượng và giám sát tuân thủ quy định nơi yêu cầu một số lượng lớn các xét nghiệm.