Định danh các phân tử nhỏ sử dụng MS/MS với độ chính xác khối cao và tốc độ cao

Tác giả: Si-Hung Le

Lời giới thiệu: TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá (metabolites) và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492. Bài viết này trình bày một vài quan điểm cá nhân của tác giả và cung cấp 1 số khái niệm cơ bản liên quan tới khối phổ phân giải cao và 1 số giải pháp trong định danh các phân tử nhỏ sử dụng khối phổ phân giải cao, cung cấp thêm thông tin về kỹ thuật ghi phổ MS/MS tiên tiến như Zeno SWATH và ZT SCAN DIA cũng như các lưu ý khi tham chiếu các thư viện phổ.

1. Giới thiệu

Trong lĩnh vực phân tích khối phổ, đặc biệt là phân tích các hợp chất nhỏ (small molecules), việc xác định cấu trúc chính xác đòi hỏi sự kết hợp giữa thiết bị có độ phân giải cao, phương pháp thu nhận phổ phù hợp và các thuật toán tìm kiếm phổ hiệu quả. Một trong những yếu tố then chốt hiện nay là khả năng thu nhận phổ MS/MS với tốc độ cao nhưng vẫn duy trì độ chính xác về khối (mass accuracy) và độ phân giải phổ (resolving power). Đây là nền tảng để đạt được hiệu quả định danh cao trong các phân tích không mục tiêu, nơi dữ liệu cần có độ bao phủ phổ rộng và độ tin cậy cao.

Tuy nhiên, việc xác định các hợp chất nhỏ bằng khối phổ tandem với số khối chính xác vẫn gặp nhiều khó khăn, bao gồm: (1) sự phức tạp của nền mẫu, (2) hiện tượng đồng phân và đồng khối (isobaric compounds), (3) phổ MS/MS nghèo nàn do phân mảnh không tối ưu, và (4) cơ sở dữ liệu phổ chưa đầy đủ hoặc không tương thích với hệ thống đang sử dụng. Đặc biệt, các phân tử nhỏ thường tạo ra phổ phân mảnh có số lượng ion con ít, làm giảm độ tin cậy khi tham chiếu với thư viện phổ.

Để khắc phục các giới hạn trên, quy trình xác định hiện đại thường bao gồm: (1) thu nhận phổ MS/MS ở nhiều mức năng lượng phân mảnh (multi-CID, ví dụ 10, 20, 40 eV) hoặc ở nhiều chế độ phá mảnh (e.g., CID và EAD), (2) sử dụng linh hoạt các chế độ thu nhận dữ liệu phụ thuộc (DDA) hoặc không phụ thuộc (DIA như SWATH-MS), (3) áp dụng thuật toán tìm kiếm phổ nâng cao (dot-product, reverse dot-product, machine learning), và (4) tận dụng các thư viện phổ đáng tin cậy như NIST, MoNA, METLIN, LipidBlast… Để đảm bảo thu được tín hiệu tốt và chứa nhiều thông tin quan trọng, tất cả những bước này đều đòi hỏi hệ thống khối phổ không những phải có khả năng thu nhận phổ MS, mà còn phải có khả năng ghi phổ MS/MS nhanh, chính xác và ổn định.

SWATH-MS là một kỹ thuật thu nhận dữ liệu kiểu không phụ thuộc DIA, trong đó toàn bộ dải khối được chia thành nhiều cửa sổ liên tiếp (thường 10–25 Da), và tất cả các ion tiền chất trong mỗi cửa sổ đều được phân mảnh và ghi phổ MS/MS. Không giống DDA, SWATH không bỏ sót các ion có cường độ thấp, giúp tăng độ bao phủ phân tích – một yêu cầu then chốt trong metabolomics, proteomics hay phân tích không mục tiêu. Khi sử dụng DDA, các hệ thống khối phổ hiện đại cho phép lựa chọn cửa sổ cô lập ion tiền chất khá rộng (0,7–9 Da), tuy nhiên trong thực tế, cửa sổ này thường được thiết lập trong khoảng 1 đến 3 Da để tăng độ nhạy của MS/MS do nhiều ion mẹ có thể được đi vào và phá mảnh, tùy theo thiết bị. Ngược lại, với DIA, cửa sổ cô lập ion tiền chất thường rộng hơn nhiều, phụ thuộc vào thiết lập của phương pháp thu nhận MS/MS tuần tự. Ví dụ, kỹ thuật SWATH-MS/MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Fragment-Ion Spectra, của SCIEX) thường sử dụng các cửa sổ 20–50 Da. Trong khi đó, các phương pháp thu nhận tất cả ion phân mảnh khác (all-fragment-ion approaches của ThermoFischer Scientific - AIF) có thể sử dụng cửa sổ rất lớn, từ 600 đến 2000 Da. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ hiệu quả nếu thiết bị có khả năng ghi phổ MS/MS với tốc độ cao và độ chính xác khối tốt. Tuy nhanh hơn và toàn diện hơn so với DDA, AIF phá mảnh toàn bộ các ion mẹ, và do đó mất hoàn toàn thông tin về sự liên hệ giữa ion mẹ và các ion con, trong khi với SWATH DIA 1 phần thông này vẫn có thể bị mất, và do đó cần dựa vào thông tin từ thời gian lưu để giải trập phổ MS2.

Đối với các thiết bị khối phổ time-of-flight (TOF), độ phân giải khối (mass resolving power) vẫn được duy trì ổn định ngay cả khi tăng tốc độ thu nhận phổ. Ngược lại, với các công nghệ dựa trên Fourier transform, như bẫy ion quỹ đạo (ví dụ thiết bị Q Exactive HF), tốc độ ghi MS/MS có thể đạt tới 18 Hz nhưng độ phân giải chỉ khoảng 18.000 FWHM tại m/z 200. Nếu người dùng muốn tăng độ phân giải lên mức 240.000 FWHM, thì tốc độ quét giảm đáng kể xuống chỉ còn 1,5 phổ/giây (1,5 Hz), điều này là quá chậm đối với các phân tích UHPLC tốc độ cao. Tuy nhiên ở các thế hệ sau của Orbitrap, tốc độ ghi MS/MS cũng đã được cải thiện 1 cách đáng kể lên tới 270 Hz (Obitrap Astral). Đối với yêu cầu gán danh tính được nhiều hợp chất nhất có thể bằng giao thức LC-MS/MS sẵn có, người dùng có thể chọn 1 trong 2 cách tiếp cận, Một là thu hẹp khoảng khối của ion tiền chất và chia quá trình thu nhận thành nhiều lần chạy riêng biệt (e.g., sử dụng SWATH DIA). Hai là thực hiện các lần chạy LC-MS/MS dài hơn để cải thiện độ phân giải đỉnh sắc ký, hoặc thu nhận phổ MS/MS chuyên biệt trong nhiều lần chạy chỉ với một vài mẫu chọn lọc, thay vì áp dụng cho toàn bộ mẫu trong nghiên cứu. So với cách tiếp cận thứu 2, cách tiếp cận 1 sẽ khả dĩ hơn do làm giảm đáng kể thời gian phân tích và không ảnh hưởng tới thông lượng phân tích.

Hình 1. Mô tả DDA và DIA (DOI: 10.1002/mas.21535)

Hình 2. Các hệ thống khối phổ hiện đại có khả năng ghi nhận nhiều mức năng lượng phân mảnh (CID) trong mỗi lần quét. Do đó, các thư viện phổ MS/MS hiện đại ngày nay thường được xây dựng với nhiều mức CID khác nhau, chẳng hạn như 10, 20 và 40 eV, nhằm tăng xác suất định danh hợp chất. Hình minh họa cho thấy việc tham chiếu một phổ MS/MS thực nghiệm của catechin, thu nhận ở chế độ ion hóa âm ESI(−), với các phổ tham chiếu ở 10, 20 và 40 eV. Nếu thư viện chỉ chứa phổ ở mức 40 eV hoặc một mức duy nhất, điểm tham chiếu (hit score) thu được sẽ rất thấp (DOI: 10.1002/mas.21535)

2. Tốc độ ghi MS/MS là điều kiện cần

Không thể phủ nhận độ chính xác khối là điều kiện vô cùng quan trọng, tuy nhiên nghiên cứu của nhóm tác từ phòng thí nghiệm O. Fiehn (Genome Center, Metabolomics, UC Davis, Davis, California) chỉ ra ngay cả độ chính xác khối < 1 ppm vẫn là chưa đủ để tin cậy xác định 1 chất và thông tin từ MS/MS là cần thiết (DOI: 10.1186/1471-2105-7-234). Nắm bắt nhu cầu này, các hệ thống QTOF từ SCIEX đã được thiết kế để có tốc độ thu phổ MS/MS vượt trội từ các dòng thiết bị TripleTOF 6600/6600+ và X500R, với tốc độ lên tới 100 phổ MS/MS mỗi giây, cùng độ phân giải ~35.000 FWHM và độ chính xác khối dưới 2 ppm (Bảng 1). So với các thiết bị Orbitrap cao cấp như Q Exactive HF (18 spectra/s) hay Orbitrap Fusion (15 spectra/s), SCIEX QTOF cho tốc độ thu nhận phổ nhanh gấp nhiều lần, đồng thời duy trì độ chính xác và độ phân giải cao, ngay cả với các hợp chất ở nồng độ thấp. Tốc độ ghi phổ cao này mang lại lợi thế đặc biệt trong các phân tích không mục tiêu (untargeted metabolomics), nơi các đỉnh sắc ký chỉ kéo dài vài giây trong UHPLC. Với khả năng ghi phổ MS/MS tốc độ cao, các hệ QTOF của SCIEX có thể ghi nhận nhiều lần phổ MS/MS cho cùng một ion tiền chất, giúp cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, tăng độ lặp và nâng cao chất lượng tham chiếu phổ với thư viện. Ngoài ra, khả năng thu nhận nhanh cũng giúp phân tích hiệu quả các mẫu sinh học, thực phẩm hoặc môi trường, vốn thường phức tạp và có nhiều chất có cùng thời gian lưu.

Bảng 1. Tốc độ ghi phổ MS/MS của 1 số thiết bị MS phân giải cao trên thị trường (DOI: 10.1002/mas.21535)

Thiết kế tiên tiến của đầu dò và hệ thống xử lý tín hiệu xuyên suốt tuân thủ triệt để triết lý thiết kế nhắm tới độ nhạy và sự dễ bảo trì (người dùng thường có thể tự vệ sinh hệ thống dẫn ion mà không cần tới kỹ sư của hãng) đảm bảo tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cao, trong khi cấu trúc mở hỗ trợ linh hoạt các chế độ DDA, đặc biệt là SWATH, sau này là Zeno SWATH và ZT scan DIA trên SCIEX 7600+ và ZT scan DIA 2.0 trên SCIEX 8600. SCIEX 8600 cho phép đẩy tốc độ ghi tín hiệu MS/MS lên tới ~850 phổ/giây mà vẫn duy trì độ nhạy gấp nhiều lần các thiết bị khác cùng khả năng loại bẩn ấn tượng nhờ sử dụng hệ thống dẫn ion mới nhất thiết kế cho SCIEX Triple Quad 7500+. Hệ thống SCIEX ZenoTOF 8600 đại diện cho thế hệ tiếp theo trong dòng QTOF tích hợp công nghệ Zeno trap, kế thừa và nâng cấp từ nền tảng ZenoTOF 7600+ vốn đã rất mạnh mẽ. Cả hai hệ thống đều hỗ trợ tốc độ thu nhận MS/MS cực cao lần lượt lên đến 640 phổ/giây ( trên 7600+) và 858 phổ/giây (trên 8600), độ chính xác khối <1–2 ppm, và tích hợp chế độ Zeno trap-enhanced SCAN DIA (ZT-SCAN DIA). ZT-SCAN là kỹ thuật thu nhận dữ liệu MS/MS mới được SCIEX phát triển, kết hợp giữa khả năng phân tích phổ toàn diện của chế độ DIA với hiệu suất thu ion vượt trội của công nghệ Zeno trap. Không giống các phương pháp DIA truyền thống, vốn ghi phổ MS/MS ở từng cửa sổ m/z rời rạc, ZT-SCAN DIA cho phép thu nhận phổ MS/MS toàn vùng khối lượng bằng cách quét liên tục (scan) qua các cửa sổ phân mảnh, đồng thời đồng bộ hóa quá trình giải phóng ion bằng Zeno trap. Kết quả là, mỗi phổ MS/MS ghi nhận có tín hiệu cao hơn, độ phân giải tốt hơn và độ bao phủ phổ đầy đủ hơn, ngay cả với các hợp chất ở nồng độ rất thấp. Lợi ích của ZT-SCAN DIA đặc biệt rõ rệt trong các ứng dụng metabolomics không mục tiêu, xác định chất chuyển hóa thuốc, và tuyển chọn hợp chất mới, nơi yêu cầu phát hiện được nhiều hợp chất nhất trong một lần chạy mà vẫn đảm bảo chất lượng phổ. Đây là bước tiến mang tính chuyển đổi cho các phòng thí nghiệm cần phân tích sâu và mở rộng phạm vi phát hiện mà không phải đánh đổi về tốc độ hay độ chính xác.

3. SCIEX ZenoTOF 8600 hướng tới hiệu suất tối ưu cho không chỉ cho phân tích proteomics mà còn cho phân tích phân tử nhỏ, chất chuyển hóa, và ứng dụng không mục tiêu yêu cầu độ nhạy cao.

Một trong những nâng cấp đáng chú ý là hiệu suất Zeno trap cải tiến: ZenoTOF 8600 đạt tăng cường tín hiệu MS/MS lên đến 20 lần, gần như 100% ion fragment được thu nhận vào TOF, nhờ cơ chế giải phóng ion đồng bộ hoàn toàn. Thiết kế buồng TOF cũng được tối ưu lại để duy trì độ phân giải khối ổn định (~35.000–40.000 FWHM) trong suốt quá trình ghi MS/MS tốc độ cao, ngay cả khi dùng Zeno trap liên tục — điều chưa từng có ở các hệ thống trước đó. Ngoài ra, hệ 8600 có giới hạn phát hiện (LOD) thấp hơn đáng kể so với 7600+, đặc biệt khi làm việc với mẫu sinh học hoặc hợp chất phân cực khó ion hóa. Hệ thống này cũng tương thích sâu hơn với các mô-đun tự động hóa và các công cụ phân tích đa chiều, mở rộng phạm vi ứng dụng trong môi trường sản xuất, giám sát an toàn thực phẩm, hoặc nghiên cứu dược động học chuyên sâu. Hơn nữa, phần mềm SCIEX OS và thư viện phổ do SCIEX phát triển tương thích sâu với phần cứng, tạo thành một hệ sinh thái tích hợp tối ưu cho phân tích phân tử nhỏ.

4. Điều kiện và lưu ý khi tìm kiếm phổ MS/MS trong cơ sở dữ liệu

Sau khi thu được 1 tập số liệu giàu thông tin, chất lượng cao gồm cả MS1 và MS2, việc tra cứu dữ liệu phổ MS/MS để định danh hợp chất nhỏ là một quy trình tương đối dễ thực hiện, nhưng đòi hỏi phải đáp ứng một số điều kiện kỹ thuật quan trọng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Loại phổ và độ chính xác khối: Người dùng cần xác định rõ thư viện sử dụng có chứa số khối chính xác (accurate mass) hay chỉ có số khối nguyên (unit mass). Việc không khớp giữa dữ liệu đo và thư viện (ví dụ: phổ thực nghiệm chính xác khối nhưng thư viện chỉ có unit mass) sẽ gây ra sai lệch hoặc không tìm được kết quả phù hợp.
Phù hợp thiết bị: Nên tham chiếu phổ từ cùng loại thiết bị (ví dụ: phổ QTOF nên được so với thư viện QTOF). Tham chiếu phổ từ các loại thiết bị khác nhau (ion trap vs QTOF) sẽ làm thay đổi điểm số đánh giá (hit score) và giảm độ tin cậy.
Độ chính xác khối thực nghiệm: Người dùng cần hiệu chuẩn khối chính xác bằng các chất chuẩn nội hoặc ngoại trước mỗi loạt thí nghiệm. Việc giả định độ chính xác khối mà không kiểm tra thực nghiệm có thể dẫn đến sai số m/z đáng kể và định danh sai.
Chế độ ion hóa: Cần phân biệt rõ dữ liệu MS/MS được thu ở chế độ dương hay âm (ESI+/−), và chỉ nên tìm kiếm trên thư viện tương ứng để tránh gán nhầm.
Dạng ion và adduct: Các adduct phổ biến như [M+H]+, [M−H]−, [M+Na]+, [M+HCOO]−… cần được xét đến vì chúng ảnh hưởng đến mẫu phân mảnh. Dữ liệu MS/MS thu với các adduct khác nhau sẽ tạo ra phổ khác biệt, dễ gây sai số nếu không được phân loại đúng.
Dạng phổ profile vs centroid: Phổ ở chế độ profile thường tạo điểm số khớp cao hơn nhưng file nặng, thời gian tìm kiếm lâu. Phổ centroid nhỏ gọn hơn, tìm kiếm nhanh hơn, phù hợp cho xử lý hàng loạt.
Nhiều mức năng lượng phân mảnh (collision energy): Nên thu phổ MS/MS ở nhiều mức CID (ví dụ 10, 20, 40 eV) hoặc sử dụng chế độ dải năng lượng (ramp) để tăng xác suất định danh đúng, vì phổ tại các năng lượng khác nhau cho thông tin phân mảnh khác nhau.
Phá mảnh tại nguồn (in-source fragmentation) và ion giả: Các ion hình thành do phân rã trong nguồn hoặc phản ứng phụ có thể ảnh hưởng đến chất lượng phổ và cần được tính đến trong quá trình tìm kiếm.
Hạn chế theo phân loại (taxonomy filter): Trong một số trường hợp, có thể giới hạn tìm kiếm theo nhóm sinh vật (ví dụ: không bao gồm hợp chất đặc trưng chỉ có ở tảo lục nếu đang phân tích huyết tương người). Tuy nhiên, việc này cần thận trọng để không bỏ sót các hợp chất bất ngờ.

5. Xử lý hậu kỳ sau khi tìm kiếm phổ MS/MS

Sau khi thực hiện tìm kiếm phổ MS/MS trong cơ sở dữ liệu, người dùng sẽ nhận được danh sách các kết quả so khớp, bao gồm tên hợp chất, điểm số đánh giá, sai số khối chính xác (mass error), và các liên kết đến cơ sở dữ liệu hóa học truyền thống. Tuy nhiên, danh sách này không phải lúc nào cũng hoàn toàn chính xác, do đó cần được kiểm tra kỹ để loại bỏ các gán nhãn sai (false positives) hoặc bỏ sót (false negatives). Một số vấn đề phổ biến:

Tổ hợp tín hiệu từ nhiều adducts hoặc đồng phân (feature combination): Một hợp chất có thể xuất hiện dưới nhiều dạng adduct khác nhau ([M+H]+, [M+Na]+, [M+NH₄]+…), hoặc ở các thời gian lưu khác nhau nếu có đồng phân. Mỗi adduct có thể tạo phổ phân mảnh khác nhau, nhưng sự lặp lại của các adduct này lại là dấu hiệu củng cố độ tin cậy trong định danh.
Tổng hợp tín hiệu adduct để định lượng: Trong các phân tích định lượng như metabolomics, cần gộp các adduct của cùng một hợp chất để có biểu diễn sinh học hợp lý hơn. Tuy nhiên, các adduct này thường có đỉnh sắc ký và cường độ khác nhau, tùy thuộc vào pha động và các chất điều chỉnh, nên việc gộp cần được thực hiện cẩn thận. Một cách đơn giản là cộng cường độ đỉnh của tất cả adduct liên quan và báo cáo như một tín hiệu tổng hợp.
Dữ liệu ion mobility (DTIMS, TWIMS): Các thiết bị có tích hợp kỹ thuật phân tách theo độ linh động ion (ion mobility) có thể phân biệt các đồng phân lập thể (stereoisomers), dẫn đến phát sinh thêm phổ MS/MS cần xử lý. Điều này đòi hỏi thuật toán hậu xử lý phức tạp hơn.
Sử dụng thời gian lưu (RT) hoặc chỉ số lưu (RI): Thời gian lưu sắc ký là một chỉ số phân biệt độc lập với phổ MS/MS, và rất hữu ích để xác nhận hoặc loại bỏ kết quả nghi ngờ. Một số thư viện phổ MS/MS hiện nay (như ReSpect DB hay METLIN PCDL của Agilent) đã bổ sung thông tin RT tương ứng với cột sắc ký, dung môi và gradient sử dụng.
Xử lý số lượng phổ lớn: Khi xử lý hàng triệu phổ MS/MS, có thể áp dụng các thuật toán nhóm phổ (spectral clustering) từ lĩnh vực proteomics để tối ưu hóa lưu trữ và giảm lặp.

6. Phần mềm hỗ trợ tìm kiếm phổ MS/MS cho hợp chất nhỏ

Trong lịch sử, phần mềm tìm kiếm phổ thường tập trung vào dữ liệu MS đơn cấp (MS1) và phổ ion hóa điện tử (EI 70 eV) từ GC-MS. Tuy nhiên, trong 20 năm gần đây, trọng tâm đã chuyển sang xử lý dữ liệu MS/MS, bao gồm các phổ CID và HCD từ LC-MS/MS. Dưới đây là một số phần mềm tiêu biểu chuyên hỗ trợ tìm kiếm phổ MS/MS cho phân tử nhỏ (Bảng 2):

NIST MS Search GUI

Chuẩn vàng cho tìm kiếm phổ MS/MS.
Hỗ trợ so khớp đầu-đuôi (head-to-tail), hiển thị cấu trúc, điểm số và các thuộc tính bổ sung.
Hỗ trợ thư viện tùy chỉnh và tìm kiếm có điều kiện.
Miễn phí và dễ sử dụng.

NIST MSPepSearch

Tối ưu cho xử lý hàng loạt (batch), tìm kiếm hàng chục ngàn phổ MS/MS rất nhanh.
Hỗ trợ định dạng MGF/MSP và xuất kết quả dạng TSV dễ xử lý với Excel.
Có thể xử lý ~5000 phổ/giây.

ACD/Spectrus & ACD/MS Workbook Suite