Đang tải...
1 Giới thiệu
Kháng thể liên hợp thuốc (ADC) là các thuốc điều trị lai, liên kết một kháng thể đơn dòng với một payload gây độc tế bào thông qua một cầu nối hóa học. Mặc dù thiết kế này cho phép phân phối thuốc trúng đích đến các tế bào ung thư, nhưng nó cũng tạo ra những thách thức phân tích riêng biệt. Cần có các quy trình làm việc chuyên biệt để nắm bắt hành vi dược động học và dược lực học của từng thành phần trong ADC.
Quy trình định lượng ADC thường bao gồm ba phép thử chính: định lượng payload tự do, tổng kháng thể và ADC liên hợp (được đo bằng payload hoặc bằng peptide) (Hình 1). Các phép thử payload liên hợp đặc biệt có giá trị khi sử dụng các cầu nối có thể phân tách (cleavable linkers) và khi có sẵn kháng thể kháng payload, mang lại cả tính đặc hiệu và độ nhạy để theo dõi độ ổn định của payload. Ngược lại, các phép thử peptide liên hợp được ưu tiên khi ADC mang các cầu nối không thể phân tách (non-cleavable linkers) hoặc khi các chiến lược liên hợp không đồng nhất khiến việc đo trực tiếp payload ít đại diện hơn cho mức độ tiếp xúc thực tế của ADC.
TDxd đóng vai trò là một ADC mô hình phù hợp để chứng minh quy trình này, nhờ vào cầu nối có thể phân tách và sự sẵn có của kháng thể kháng payload chọn lọc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày một quy trình định lượng ADC đa phép thử, nhạy, bao gồm các phép đo payload tự do, tổng kháng thể, ADC liên hợp dựa trên payload và ADC liên hợp dựa trên peptide.
2 Phương pháp
Chuẩn bị mẫu để định lượng payload tự do: Dxd được hòa tan trong DMSO và pha loãng với hỗn hợp nước:acetonitrile tỉ lệ 1:1 (v/v) để thu được các chất chuẩn làm việc. Dung môi thêm chuẩn (spike-in) được chuẩn bị bằng cách kết tủa huyết tương với methanol theo tỉ lệ 1:3 (v/v), sau đó pha loãng với nước để thu được dung môi cuối cùng chứa 10% methanol. Đường chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm 5 µL chất chuẩn làm việc vào 95 µL dung môi thêm chuẩn.
Kết tủa miễn dịch để định lượng tổng kháng thể và ADC dựa trên payload: Phenomenex BioZen MagBeads (20 mg/mL) được chuẩn bị theo hướng dẫn sử dụng. Kháng thể dê kháng IgG người được gắn biotin được thêm vào các hạt và hỗn hợp được ủ trong 1 giờ ở 21 °C. Các hạt được rửa ba lần và sau đó hoàn nguyên trong PBS. Các chất chuẩn hiệu chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm TDxd vào 100 µL huyết tương chuột và vortex nhanh.
25 µL hạt liên hợp và các chất chuẩn nội đánh dấu đồng vị ổn định được thêm vào hỗn hợp và ủ để bắt giữ miễn dịch (immunocapture). Sau một giờ ủ, các hạt được rửa lần lượt bằng PBS và amoni bicarbonate 10 mM. Để giải hấp, các hạt được ủ trong 100 µL nước chứa 0,1% TFA trong 10 phút. Mẫu được chia thành 2 bộ. Một thể tích 50 µL được sử dụng để phân tích định lượng tổng kháng thể. Mẫu được trung hòa bằng amoni bicarbonate 500 mM, sau đó thêm trypsin với nồng độ 1 µg mỗi giếng và ủ qua đêm ở 37 °C. Phản ứng được kết thúc bằng axit formic. 50 µL còn lại được sử dụng để tiêu hóa bằng papain nhằm định lượng payload liên hợp. 10 µL papain 100 µg/mL được thêm vào mỗi giếng và ủ qua đêm. Quá trình tiêu hóa được kết thúc bằng cách thêm 10 µL axit formic 10% trong nước.
Chuẩn bị mẫu để định lượng ADC dựa trên peptide: 1 µg kháng thể kháng Dxd gắn biotin được thêm vào các hạt BioZen MagBeads đã rửa và ủ trong 1 giờ ở 21 °C. Từ các bước rửa trở đi, quy trình tương tự như phương pháp tổng kháng thể đã được thực hiện.
Sắc ký: Tất cả các mẫu được vortex, ly tâm và chuyển sang các lọ đựng mẫu. Việc tách được thực hiện trên hệ thống ExionLC AD sử dụng cột Phenomenex Kinetex C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm, 100 Å) cho tất cả các phương pháp. Dung dịch axit formic 0,1% (v/v) trong nước được sử dụng làm pha động A và axit formic 0,1% (v/v) trong acetonitrile được sử dụng làm pha động B. Bảng 1 hiển thị gradient LC cho các phép thử payload tự do và liên hợp, và Bảng 2 hiển thị gradient LC cho các phép thử tổng kháng thể và ADC.
