Đang tải...
Kỹ thuật kết tủa protein trong xử lý mẫu máu trong phân tích độc học pháp y: Thách thức, phương pháp, lưu ý và xu hướng.
Tác giả: Si-Hung Le
Lời giới thiệu: TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá (metabolites) và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492. Bài viết này trình bày một vài quan điểm cá nhân của tác giả và cung cấp 1 số khái niệm cơ bản liên quan tới việc xử lý mẫu máu trong phân tích độc học pháp y sử dụng kỹ thuật kết tủa protein nhằm đảm bảo độ chính xác, độ nhạy và tính tái lập. Mẫu máu pháp y, đặc biệt là từ tử thi, đặt ra nhiều thách thức do hiện tượng tái phân bố thuốc, phân hủy sinh học và nền mẫu sinh học phức tạp. Bài viết này trình bày tổng quan về các vấn đề thường gặp trong xử lý mẫu máu pháp y khi sử dụng kỹ thuật kết tủa protein như 1 kỹ thuật xử lý mẫu truyền thống, dễ triển khai và chi phí thấp, cũng như các lưu ý nhằm đảm bảo kết quả phân tích đáng tin cậy.
1. Những thách thức trong xử lý mẫu máu pháp y
1.1 Tính chất đặc thù của mẫu máu pháp y
Trong độc chất học pháp y, sau khi tử vong, hàng loạt quá trình sinh hóa tiếp diễn trong cơ thể có thể ảnh hưởng đáng kể đến tính chính xác và khả năng diễn giải kết quả phân tích. Khi ngừng cung cấp oxy, tế bào chuyển sang con đường chuyển hóa kỵ khí, dẫn đến tích tụ axit lactic và ADP, làm giảm pH nội bào và phá vỡ tính toàn vẹn của màng tế bào. Hậu quả là các enzym nội bào như protease và lipase được giải phóng, thúc đẩy sự phân hủy cấu trúc tế bào. Một số enzym chuyển hóa thuốc, bao gồm cả β-glucuronidase, vẫn hoạt động trong thời gian ngắn sau khi chết và có thể tái sinh dạng thuốc ban đầu từ các chất liên hợp. Trong khi đó, các enzym oxy hóa như succinate dehydrogenase và cytochrome oxidase mất hoạt tính trong vòng 24–36 giờ đầu, làm gián đoạn các cơ chế chuyển hóa thuốc nội sinh và ngoại sinh. Đồng thời, vi khuẩn đường ruột bắt đầu xâm lấn vào tuần hoàn và mô lân cận thông qua quá trình tự phân và thối rữa, gây ra các biến đổi hình thái như “marbling” và giải phóng các enzym vi sinh có khả năng biến đổi hoặc phá hủy chất phân tích [1].
Trong giai đoạn phân hủy, hiện tượng tái phân bố thuốc (PMR) cũng góp phần làm thay đổi nồng độ xenobiotic trong mẫu máu. Các thuốc có thể khuếch tán từ các cơ quan giàu thuốc như gan, phổi, tim vào máu, làm tăng nồng độ trong các mẫu trung tâm, đặc biệt là máu tim, so với các mẫu lấy từ tĩnh mạch đùi – vốn được xem là đại diện đáng tin cậy hơn cho nồng độ hệ tuần hoàn tại thời điểm tử vong. Ngoài ra, nồng độ các chất phân tích còn có thể tiếp tục biến đổi trong quá trình bảo quản và xử lý mẫu, đặc biệt nếu thi thể không được bảo quản lạnh kịp thời hoặc mẫu bị nhiễm vi sinh vật. Mẫu máu sau khi chết còn đối mặt với các yếu tố gây nhiễu phức tạp: sự tan huyết, sự thấm dịch mô, thay đổi pH và sự xuất hiện của các sản phẩm phân hủy có trọng lượng phân tử thấp như putrescine và cadaverine – có thể làm sai lệch kết quả trong các kỹ thuật phân tích nhạy như khối phổ. Nền mẫu chứa nhiều protein, lipid, muối và mảnh vụn tế bào có thể gây nhiễu ion, giảm hiệu suất chiết và ảnh hưởng đến hiệu quả ion hóa, từ đó làm giảm độ chính xác và độ tin cậy của các phép phân tích định lượng. Những yếu tố này cho thấy tầm quan trọng của việc chọn đúng vị trí lấy mẫu, bảo quản mẫu hợp lý và diễn giải kết quả trong bối cảnh rõ ràng về tình trạng tử thi và điều kiện sau tử vong.
1.2 Các vấn đề thiết bị và hiệu ứng phân tích
Mẫu sinh học chưa qua xử lý kỹ trước khi phân tích không chỉ gây tắc nghẽn hệ thống ống dẫn và kim tiêm tự động mà còn có thể làm hỏng cột sắc ký và nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ. Các hợp chất không bay hơi, đặc biệt là phospholipid, thường tích tụ tại nguồn ion hóa, gây hiện tượng nhiễm bẩn, làm giảm độ ổn định tín hiệu và yêu cầu vệ sinh nguồn thường xuyên, từ đó làm giảm hiệu suất và tuổi thọ của thiết bị. Ngoài ra, các tạp chất nền cũng là nguyên nhân chính dẫn đến hiệu ứng nền mẫu (matrix effect), biểu hiện phổ biến nhất là hiện tượng ion suppression – là sự suy giảm hiệu suất ion hóa của chất phân tích do cạnh tranh điện tích với các hợp chất đồng rửa giải hoặc do tương tác bề mặt làm cản trở quá trình tạo ion. Trong một số trường hợp ngược lại, ion enhancement cũng có thể xảy ra, khi một số thành phần nền làm tăng tín hiệu bằng cách tạo ion trùng khối hoặc tăng cường khả năng ion hóa không đặc hiệu của chất phân tích. Cả hai hiện tượng này đều làm sai lệch tín hiệu đo được, ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác, độ lặp lại và đặc biệt là giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích. Do đó, quá trình xử lý mẫu đóng vai trò then chốt trong việc loại bỏ các thành phần gây nhiễu, chuẩn hóa nền mẫu, và đảm bảo độ tin cậy cho các phép phân tích định lượng bằng kỹ thuật LC-MS/MS trong độc chất học pháp y.
2. Phương pháp kết tủa protein
Trong xử lý mẫu máu các kỹ thuật cơ bản như lọc, ly tâm, kết tủa protein (PPT) và chiết lỏng-lỏng (LLE) vẫn giữ vai trò quan trọng trong tiền xử lý mẫu do tính đơn giản, dễ triển khai, chi phí thấp. Kết tủa protein là một trong những kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng và phổ biến nhất để xử lý các mẫu sinh học, bao gồm huyết tương, huyết thanh và máu toàn phần. Mục tiêu chính của PPT là loại bỏ protein gây nhiễu nhằm giảm hiệu ứng nền mẫu trong LC-MS/MS, bảo vệ nguồn ion hoá và tăng độ ổn định của hệ thống. Trong kỹ thuật này việc thêm dung môi kết tủa (crashing solvent) hữu cơ phân cực thường là các dung môi tan trong nước – “water miscible organic solvents” (ví dụ: methanol (MeOH), acetonitrile (ACN)) vào mẫu sinh học nhằm phá vỡ cấu trúc bậc ba của protein, làm giảm độ hòa tan và gây kết tủa [2]. Cụ thể, việc thêm các dung môi hữu cơ tan trong nước có thể phá bỏ lớp phân tử nước bao bọc xung quanh các phân tử protein (hydration layer of protein), làm giảm lực đẩy giữa các phân tử protein và làm giảm đáng kể khả năng tan của chúng. Do đã mất đi lớp nước bao quanh, các phân tử protein sẽ có xu hướng tương tác với nhau và có thể được kết tủa qua quá trình ly tâm hoặc lọc. Trong khi ly tâm, các protein bị lực ly tâm kéo sát vào nhau tạo thành các cụm protein lớn (kết tủa) và dính xuống đáy của ống chứa mẫu (protein pellete). Phần dịch nổi chứa chất quan tâm sẽ được sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Việc sử dụng ACN thường tạo kết tủa lớn, dễ loại bỏ hơn và làm sạch mẫu tốt hơn so với MeOH. Sử dụng MeOH thường cho kết tủa mịn, khó ly tâm hơn, nhưng có thể giữ lại các hợp chất phân cực tốt hơn (Hình 1). Độ trong của phần dịch nổi cũng thể hiện hiệu quả của quá trình kết tủa protein, dịch nổi càng trong chứng tỏ nhiều protein được loại bỏ khỏi mẫu hơn. Hình 2 thể hiện hiệu ứng của việc kết hợp với việc giữ lạnh mẫu ở 10 oC trong 24 giờ liên tục, mẫu sử dụng ACN với tỉ lệ 3:1, cho dịch nổi trong hơn hẳn các mẫu còn lại (Hình 2) [3]. Một số nghiên cứu cho thấy ACN có khả năng loại bỏ hơn 90% protein trong mẫu huyết tương và mẫu máu toàn phần, trong khi việc sử dụng MeOH thường chỉ đạt khoảng 70–80% [4]. Tuy nhiên, ACN có thể kém hiệu quả hơn trong việc hòa tan một số thuốc phân cực, do bản chất ACN ít phân cực hơn và do các chất phân cực sẽ khó đi vào ACN hơn.
Hình 1. Ảnh hưởng của dung môi và tỉ lệ dung môi tới quá tình kết tủa protein, sử dụng ACN cho ra kết tủa lớn màu vàng đông đặc, trong khi dùng MeOH cho ra các hệt kết tủa trắng mịn hơn.
Hình 2. Kết hợp với giữ lạnh ở 10 oC trong 24 giờ, dịch nổi trở nên trong nhất với tỉ lệ ACN: mẫu/ 3:1 (v:v) [3]
Ngoài thành phần của dung môi kết tủa protein, thì tỷ lệ giữa dung môi và mẫu cũng đóng vai trò quan trọng quyết định hiệu quả PPT. Tỷ lệ thông dụng là thường được sử dụng giữa dung môi hữu cơ và mẫu là từ 3:1 tới 5:1 (v/v)/ Dung môi hữu cơ: Mẫu máu. Tỉ lệ này thường cho hiệu quả tốt cho phần lớn mẫu sinh học và được sử dụng như điều kiện bắt đầu trong nhiều nghiên cứu. Đôi khi tỉ lệ lớn hơn cũng có thể được sử dụng nhằm tăng hiệu suất kết tủa nhưng có thể làm pha loãng chất phân tích quá mức, ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện. Ví dụ, với mẫu máu toàn phần 100 µL, việc thêm 300–400 µL ACN cho kết quả tối ưu trong việc loại bỏ protein mà vẫn giữ lại phần lớn chất phân tích trong pha nổi. Việc sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/ACN đôi khi được sử dụng để cân bằng hiệu quả chiết và khả năng loại bỏ protein. Một lượng nhỏ 5-15% MeOH có thể được sử dụng cùng với ACN để điều chỉnh khả năng chiết của các chất phân tích. Tuy nhiên, việc thêm 1 lượng nhỏ MeOH vào ACN cũng có thể gây ra sự thay đổi trong dung môi kết tủa và dẫn tới hiệu suất kết tủa thay đổi (Hình 3). Dịch nổi kém trong hơn khi tăng dần lượng MeOH trong dung dịch kết tủa cho cả mẫu huyết tương và máu toàn phần, do đó 15% MeOH được khuyến cáo là % thể tích tối đa của MeOH có thể được sử dụng cùng với ACN khi kết tủa protein trong mẫu máu (Hình 3A, B). Một lưu ý là trong trường hợp sử dụng màng lọc để loại bỏ các kết tủa protein, khi sử dụng ACN các hạt kết tủa thường lớn hơn và do đó quá trình lọc sẽ dễ hơn, trong khi sử dụng MeOH, các hạt kết tủa thường nhỏ và mịn hơn, nên sẽ nhanh chóng làm tắc màng lọc/frit 1 cách dễ dàng, thêm vào đó áp suất lớn hơn sẽ cần để lọc. Để làm giảm việc protein bám dính, các chất phụ gia (additivies) như axít formic (FA 1%) hoặc ammonium hydroxit (AmOH 1%) có thể được thêm vào dung dịch kết tủa. Việc thêm các chất phụ gia này vào dung dịch kết tủa, làm thay đổi pH của mẫu, thay đổi khả năng tan của các protein, chất phân tích và các chất có trong nền mẫu. Ví dụ, khi kết tủa mẫu máu toàn phần, việc thêm FA tăng khả năng chiết hemoglobin, cho ra dịch nổi có màu đỏ/nâu sẫm (Hình 3C, D). Hình 3 C, D thể hiện kết quả so sánh hiệu quả quy trình kết tủa protein mẫu máu toàn phần khi sử dụng dung dịch kết tủa là ACN với FA 1%, ACN 100% và ACN với AmOH 1%. Hình 3C thể hiện dịch nổi trước kh ly tâm và hình 3D thể hiện kết quả sau khi đã ly tâm. Kết quả chỉ ra rằng việc sử dụng 100% ACN và ACN với AmOH 1% cho ra dịch nổi sạch hơn.
Hình 3. Ảnh hưởng của các chất phụ gia lên khả năng kết tủa protein của dung dịch kết tủa: A) ảnh hưởng của MeOH khi kết tủa huyết tuơng, B) ảnh hưởng của MeOH khi kết tủa máu toàn phần, C) ảnh hưởng của chất phụ gia lên quá trình kết tủa máu mẫu toàn phần khi chưa ly tâm và D) ảnh hưởng của phụ gia lên quá trình kết tủa máu toàn phần sau khi đã ly tâm.
Với mẫu máu, có 3 loại nền mẫu chính: 1 là mẫu máu toàn phần (whole blood) thường chứa chất chống đông máu, và không được tách ra khỏi phần chất lỏng và các tế bào hồng cầu; 2 là huyết thanh (serum), là phần chất lỏng trong sau khi tách khỏi các tế bào hồng cầu, không có chứa chất chống đông cũng như các fibrinogen – là một loại protein huyết tương, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu, được gan sản xuất và khi bị tổn thương, fibrinogen sẽ chuyển đổi thành fibrin, một chất không hòa tan, tạo thành mạng lưới giúp cầm máu; 3 là huyết tương (plasma), là phần chất lỏng tách khỏi hồng cầu và có chứa các fibirnogen. Ở cùng 1 thể tích, độ phức tạp cũng như hàm lượng protein sẽ tăng dần từ huyết thanh < huyết tương < máu toàn phần (Hình 4). Kết quả trong hình 4, chỉ ra rằng lượng protein kết tủa trong mẫu máu toàn phần không những nhiều hơn mà còn có mầu nâu/đỏ, trong khi 2 loại mẫu còn lại có ít kết tủa hơn và có màu trắng/vàng.
Hình 4. Sử dụng cùng 1 quy trình kết tủa protein lên cùng 1 thể tích máu toàn phần, huyết tương, huyết thanh.
Không những chứa nhiều protein nhất, máu toàn phần có rất nhớt, việc này có thể gây ra vấn đề là khi thêm máu toàn phần vào dung dịch kết tủa, mẫu sẽ bị lắng ngay lập tức ở đáy của lọ mẫu dẫn tới giảm khả năng lắc trộn đều để tăng tính đồng nhất. Do đó 1 lượng đáng kể mẫu chưa được kết tủa vẫn có thể tồn tại trong dịch nổi và đi qua các màng lọc, cột lọc, tiền cột... Khi thao tác với máu toàn phần, dung môi kết tủa được khuyến cáo thêm vào mẫu máu toàn phần. Hình 5 thể hiện ảnh hưởng của thứ tự thêm dung môi kết tủa vào mẫu máu toàn phần (Hình 5). Trong đó, việc thêm dung môi kết tủa vào mẫu cho thấy mẫu được trộn đồng nhất tốt hơn, và do đó hiệu quả kết tủa tốt hơn. Trong khi ở thứ tự ngược lại, thêm mẫu máu toàn phần vào dung môi kết tủa, dẫn tới máu toàn phần lắng xuống đáy lọ, và dẫn tới hiệu quả kết tủa protein có thể bị ảnh hưởng.
Hình 5. So sánh sự đồng nhất mẫu giữa 2 quy trình: Hình bên trái, dung môi kết tủa được thêm vào mẫu máu toàn phần; Hình bên phải, thêm mẫu máu toàn phần vào dung môi kết tủa. Hình bên trái thể hiện mẫu có thể được trộn đều đồng nhất hơn, trong khi phần lớn mẫu ở hình bên phải bị lắng xuống đáy ống.
3. Một vài cân nhắc khi sử dụng kỹ thuật kết tủa protein
Hình 6. A,B) Thao tác đúng khi dùng đầu típ để chuyển mẫu máu vào ống/lọ chứa, đầu típ cần vuông góc, ko chạm vào thành; C,D) Thao tác đúng khi chuyển 1 lượng lớn dung dịch kết tủa vào mẫu, đầu típ nghiêng 1 góc khoảng 60o, dung dịch cần được chuyển nhẹ nhàng, tránh làm văng, bắn mẫu.
Hình 7. Sử dụng đầu típ có đường kính lỗ đầu típ lớn để dễ trộn mẫu hơn
4. Nhược điểm của kỹ thuật kết tủa protein
Kỹ thuật kết tủa protein không loại bỏ được phospholipid cũng như nhiều thành phần không bay hơi trong mẫu. Phospholipid là 1 thành phần rất quan trọng đa chức liên quan tới lớp màng tế bào và việc vận chuyển các lipid, và do đó tồn tại rất nhiều trong các mẫu máu (ví dụ: phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sphingomylein, phosphatidylserine). Các phospholipid này có 1 đầu kỵ nước (chuỗi axit béo) và 1 đầu ưa nước (phosphate) do đó dễ tan vào trong dịch nổi sau khi kết tủa protein. Do nồng độ cao của các phospholipid (lên tới 1 mg/mL trong các mẫu máu), chúng sẽ bị tách trên cột cùng với chất phân tích, đi vào nguồn ion hoá mẫu, cạnh tranh điện tích với ion chất quan tâm hạn chế khả năng tạo giọt và do đó gây hiệu ứng suy giảm tín hiệu, cũng như ảnh hưởng tới quá trình tách sắc ký (do các chất này có thể bám trên cột pha đảo và cần nhiều thời gian để làm sạch cột phân tích, có thể gây quá tải, tắc cột phân tích). Hình 8 thể hiện 1 lượng lớn các phospholipid chị bỉ rửa giải ở bước rửa cột rất dài từ phút 5-12, trong khi các chất quân tâm đi ra với thời gian lưu < 5 phút (Hình 8A). Việc này sẽ làm tăng đáng kể thời gian chạy từng mẫu, cũng như cần tới gần 10 mẫu blank sau đấy để có thể làm sạch hoàn toàn cột (Hình 8B). Người dùng cần cân nhắc sử dụng các phương pháp kết tủa protein cải tiến, ví dụ như sử dụng đĩa lọc/ cột SPE có khả năng loại phospholipid để giữ sạch thiết bị cũng như tăng khả năng tái lặp và độ tin cậy cho phương pháp phân tích.
Hình 8. A) Đường mầu đỏ, là mẫu máu toàn chỉ sử dụng kết tủa protein, tín hiệu sau phút thứ 5 là các phospholipid; B) Cần tới 10 lần bơm mẫu blank sau mẫu thật để làm sạch toàn bộ cột.
Bên cạnh việc sử dụng các kỹ thuật kết tủa protein tăng cường, một giải pháp khác là sử dụng kỹ thuật chiết lỏng lỏng (Liquid–Liquid Extraction - LLE) để có độ chọn lọc tốt hơn. Chiết lỏng–lỏng là một kỹ thuật truyền thống được sử dụng rộng rãi để chiết các chất quan tâm ra khỏi mẫu sinh học dựa trên sự khác biệt độ hòa tan giữa hai pha không trộn lẫn. Trong đó, mẫu sinh học được trộn với dung môi hữu cơ kém phân cực (ví dụ: ethyl acetate, chloroform, MTBE). Sau khi lắc trộn và ly tâm, pha chứa chất phân tích được tách ra, làm bay hơi dung môi và hoàn nguyên trước khi phân tích. Khác với PPT, là 1 phương pháp tương đối tổng quát, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng tới hiệu suất chiết LLE như pH, thành phần dung môi, tỷ lệ thể tích mẫu và dung môi, cũng như quy trình lắc/trộn mẫu. pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của chất phân tích. Ví dụ, để chiết base yếu (như opioid), môi trường mẫu nên được kiềm hóa (pH ~9) để giảm ion hóa và tăng khả năng phân bố vào pha hữu cơ. Liên quan tới việc chọn dung môi, MTBE (methyl tert-butyl ether) thường được dùng nhờ độ bay hơi cao, ít độc hại, dễ làm khô. Ethyl acetate cho khả năng chiết tốt các hợp chất trung tính và base yếu. Trong khi chloroform cho hiệu quả chiết cao nhưng độc và không thân thiện với môi trường. Để loại bỏ phospholipid tốt hơn, các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi có độ phân cực trung bình sẽ dễ hoà tan cả 2 phần của phospholipid (phần kỵ nước và ưu nước), thêm vào đó người dùng cần cân nhắc chọn hệ dung môi sao cho phospholipid tan tốt vào 1 phần, còn chất phân tích tan tốt vào phần còn lại. Việc thêm 1 lượng muối như NaCl vào hệ dung môi chiết, có thể làm giảm độ tan của các hợp chất hữu cơ phân cực nhẹ vào pha nước và do đó có thể loại bỏ các phospholipid ra khỏi pha nước mà người dùng quan tâm. Tỷ lệ thể tích mẫu và dung môi phổ biến thường từ 1:3 đến 1:5. Việc tăng thể tích dung môi thường tăng hiệu suất chiết nhưng kéo theo rủi ro làm loãng hoặc khó làm bay hơi hoàn toàn. Thêm vào đó việc lắc trộn và ly tâm cũng không kém phần quan trọng. Thời gian và cường độ lắc ảnh hưởng đến mức độ tiếp xúc giữa hai pha. Quá mạnh có thể gây tạo nhũ (emulsion), đặc biệt với mẫu máu toàn phần, do đó cần tối ưu thời gian (~5 phút) và tốc độ lắc.
Cuối cùng, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction – SPE) là kỹ thuật xử lý mẫu sinh học cho khả năng chọn lọc vượt trội so với PPT và LLE, nhờ khả năng loại bỏ tạp chất hiệu quả, cải thiện độ tinh sạch của nền mẫu, nâng cao hiệu suất thu hồi và dễ dàng tích hợp vào quy trình tự động. Các biến thể của SPE như trao đổi ion (ion-exchange SPE) hoặc pha hỗn hợp (mixed-mode SPE) cho phép tăng độ chọn lọc đối với các nhóm chất có tính chất phân cực hoặc tích điện khác nhau, đặc biệt hữu ích trong phân tích các hợp chất khó phân tách hoặc có cấu trúc tương tự. Bên cạnh đó, các kỹ thuật xử lý mẫu khác như chiết vi pha rắn (Solid Phase Microextraction – SPME), chiết khuếch tán qua màng rỗng (Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction – HF-LPME), sắc ký lọc kích thước (Size Exclusion Chromatography – SEC) và phân tán mẫu nền rắn (Matrix Solid Phase Dispersion – MSPD) đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi, mở rộng phạm vi phân tích trên nhiều loại mẫu sinh học như huyết thanh, mô, nước tiểu và dịch não tủy. Đặc biệt, các nền SPE cải tiến có khả năng loại bỏ lipid hiệu quả, giúp giảm rõ rệt hiệu ứng nền mẫu – một yếu tố thường ảnh hưởng đáng kể đến độ nhạy và độ chính xác trong các phép đo LC-MS/MS. Khác với PPT và LLE, SPE cần được tối ưu hóa cẩn thận các thông số kỹ thuật như loại dung môi rửa giải, tốc độ dòng SPE, thể tích nạp mẫu, và bước rửa chọn lọc là cần thiết nhằm tăng hiệu suất chiết, giảm nhiễu và nâng cao độ tin cậy của phương pháp. Đồng thời, cần hạn chế số bước thao tác để giảm thiểu thất thoát phân tích và nâng cao độ lặp lại. Mỗi quy trình xử lý mẫu cần được đánh giá toàn diện theo các tiêu chí hiệu năng phân tích, bao gồm: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), hiệu suất thu hồi, độ chệch, hiệu ứng nền và độ ổn định của chất phân tích. Cuối cùng, việc sử dụng chất chuẩn nội (internal standard) ngay từ giai đoạn đầu đóng vai trò thiết yếu trong việc hiệu chỉnh biến thiên do xử lý mẫu, nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả định lượng.
4. Chiến lược nâng cao hiệu quả và tự động hóa
Việc tự động hóa quy trình xử lý mẫu đang ngày càng trở thành yếu tố then chốt trong nâng cao hiệu suất và độ tin cậy của các phân tích độc học pháp y. Các nền tảng như đĩa lọc 96 giếng kết hợp với robot xử lý chất lỏng – tiêu biểu là hệ thống Eppendorf epMotion 5075 – cho phép xử lý đồng thời nhiều mẫu với độ chính xác và độ lặp lại cao, đồng thời giảm thiểu sai số thao tác và rút ngắn đáng kể thời gian chuẩn bị mẫu. Bên cạnh đó, các phương pháp lấy mẫu thể tích nhỏ như Dried Blood Spot (DBS) ngày càng được ưa chuộng nhờ thuận tiện trong bảo quản, vận chuyển và yêu cầu lượng mẫu tối thiểu – đặc biệt phù hợp với các đối tượng nhạy cảm như trẻ sơ sinh hoặc trong hoàn cảnh thu mẫu khó khăn sau tử vong.
Một trong những tiến bộ nổi bật gần đây là công nghệ acoustic droplet ejection (ADE), đã được SCIEX thương mại hóa và tích hợp vào nền tảng Echo® MS+, cho phép đẩy các giọt mẫu siêu nhỏ chính xác (2,5 nL) vào hệ khối phổ với tốc độ phân tích lên tới 1 mẫu/giây mà không cần bước sắc ký lỏng truyền thống. Việc loại bỏ LC giúp giảm thời gian phân tích đáng kể, tiết kiệm dung môi và mẫu, đồng thời giảm thiểu nguy cơ nhiễm chéo nhờ quy trình tiêm mẫu không tiếp xúc. Hệ thống này đặc biệt phù hợp với các mẫu đã qua xử lý sơ bộ (ví dụ: pha-loãng-và-đo, SPE, ultra-filter, DBS), mở ra khả năng phân tích hàng nghìn mẫu mỗi ngày. Echo® MS+ không chỉ tích hợp hiệu quả với hệ thống robot và phần mềm điều khiển quy trình mà còn hỗ trợ linh hoạt các chế độ MS như MRM và HRMS, cho phép vừa định lượng mục tiêu (targeted quantification) vừa thực hiện sàng lọc không mục tiêu (unknow screening). Điều này mang lại lợi thế đáng kể trong phân tích pháp y hậu tử vong – nơi cần giám sát nhiều chất phân tích trong nền mẫu phức tạp.
Tuy nhiên, dù công nghệ tự động hóa và tốc độ phân tích đã được cải thiện đáng kể, nguyên tắc “xử lý mẫu vừa đủ” (fit-for-purpose) vẫn giữ vai trò định hướng trong thiết kế quy trình. Việc lựa chọn phương pháp xử lý phù hợp cần dựa trên sự cân bằng giữa độ phức tạp kỹ thuật, chi phí và yêu cầu phân tích cụ thể, đồng thời tận dụng tối đa hiệu suất và độ nhạy vượt trội của các hệ thống MS hiện nay.
5. Tài liệu tham khảo
[1] DOI: 10.1007/s12024-009-9130-8
[2] https://doi.org/10.1016/S1570-0232(02)00914-5
[3] https://doi.org/10.1007/s13361-016-1568-9
[4] doi: 10.1016/s1570-0232(02)00914-5
