Đang tải...
Methods for Novel Psychoactive Substance Analysis, Methods in Pharmacology and Toxicology
Biên soạn bởi
Marta Concheiro
Department of Sciences, John Jay College of Criminal Justice, City University of New York,
New York, NY, USA
Karl B. Scheidweiler
Scientific Affairs, Toxicology R&D, Abbot/Immunalysis, Pomona, CA, USA
Chương 4: Phân tích mục tiêu của opioid tổng hợp trong máu và nước tiểu
Tác giả: Luke N. Rodda
Lời giới thiệu: Sau đây là bản tóm tắt lược dịch chương 4 từ cuốn sách: “Methods for Novel Psychoactive Substance Analysis, Methods in Pharmacology and Toxicology, của các biên tập Marta Concheiro và Karl B. Scheidweiler; DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2605-4_4”. Người dịch, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá (metabolites) và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492. Chương 4 cuốn sách này cung cấp một cái nhìn tổng quan về các phương pháp phân tích hiện tại cũng như quan điểm của tác giả liên quan tới việc phát hiện và định lượng các chất opioid tổng hợp mới (NSO) trong các mẫu sinh học như máu, huyết tương, huyết thanh và nước tiểu.
Tóm tắt
Loại NPS (chất hướng thần mới) nguy hiểm nhất là các dẫn xuất tác động lên thụ thể opioid, được gọi là các opioid tổng hợp mới (NSO). Dược lý học của các NSO này thường tương đương hoặc mạnh hơn morphine từ hàng trăm đến hàng nghìn lần. Kể từ khoảng năm 2015, sau sự gia tăng đột biến trong việc sử dụng NSO, các phòng thí nghiệm độc chất học pháp y và lâm sàng đã ghi nhận sự gia tăng đáng kể các ca quá liều — cả sống sót lẫn tử vong — liên quan đến các hợp chất này. Mặc dù morphine là opioid truyền thống, NSO có các đặc tính dược lý tương tự nhưng lại bao gồm một nhóm hợp chất rất đa dạng về cấu trúc. Chương này sẽ thảo luận về các phương pháp xét nghiệm cần thiết để phát hiện nhóm NPS này, bao gồm yêu cầu về độ nhạy, tính chọn lọc đối với các hợp chất NSO có cấu trúc tương đồng, các mục tiêu điển hình trong quá trình phát hiện và các quy trình xét nghiệm đang được sử dụng. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và phương pháp phân tích dụng cụ hiện đại cũng sẽ được xem xét, với LC-MS/MS hiện nay là công cụ được ưu tiên hàng đầu.
Từ khóa: Fentalog, Hiệu lực, Thụ thể Mu-opioid, Utopioids, Máu, Nước tiểu, LC-MS/MS
NSO bao gồm các chất tương tự fentanyl có hiệu lực rất cao, cũng như các opioid tổng hợp không thuộc nhóm fentanyl, đều tạo ra tác dụng giống opioid thông qua việc tác động lên các thụ thể opioid [1, 2]. Dược lý học của các NSO này thường tương đương hoặc mạnh hơn morphine từ hàng trăm đến hàng nghìn lần [3, 4]. NSO thường xuất hiện trong các loại thuốc giả mạo, bột, dung dịch, thuốc xịt mũi, cũng như các sản phẩm ma túy bất hợp pháp như bột trắng và heroin hắc ín [5, 6]. Một trong những trường hợp sử dụng NSO đầu tiên được ghi nhận vào năm 1979, sau một loạt ca quá liều opioid tại California liên quan đến “China White” — ban đầu bị nhầm là heroin. Tuy nhiên, kết quả phân tích độc chất học cho thấy không có heroin hoặc các opioid thông thường khác trong mẫu sinh học, mà thay vào đó là alpha-methylfentanyl (AMF) [7–9]. Năm năm sau, 3-methylfentanyl là tác nhân gây ra 16 ca tử vong do quá liều ở Pennsylvania [10].
Trên phạm vi quốc tế, Thụy Điển đã ghi nhận các trường hợp quá liều liên quan đến 4-methoxybutyrfentanyl, furanylfentanyl và sự kết hợp của cả hai hợp chất này [6]. Dù đa số các trường hợp liên quan đến NSO là quá liều tử vong không chủ ý, NSO cũng được phát hiện phổ biến trong các vụ việc liên quan đến hiệu suất của con người. Từ năm 2016 đến 2017 tại Palm Beach County, Florida, carfentanil đã được phát hiện trong một phần ba số vụ lái xe dưới ảnh hưởng của ma túy (DUID) — tỷ lệ cao hơn bất kỳ loại ma túy nào khác, bao gồm fentanyl và các chất gây suy giảm thần kinh như alprazolam [11]. Vì những lý do này, ngoài việc giám định các trường hợp tử vong, các phòng thí nghiệm nên cân nhắc sàng lọc NSO (và các NPS khác) trong các tình huống đánh giá hiệu suất của con người (NSO has been shown to be prevalent in human performance casework).
Trước sự bùng nổ nhanh chóng của các báo cáo về NPS mới, Văn phòng Liên Hợp Quốc về Ma túy và Tội phạm (UNODC) đã thành lập hệ thống Cảnh báo Sớm vào năm 2013 để theo dõi xu hướng NPS [12]. Sau đó, một cơ sở dữ liệu toàn cầu về NPS đã được phát triển, cho phép các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới báo cáo vào một hệ thống tập trung. Mặc dù tốc độ xuất hiện NPS mới nhìn chung đã chững lại hoặc giảm trong giai đoạn 2016–2020, các NSO mới vẫn tiếp tục gia tăng, với số lượng gần như gấp bốn lần trong các trường hợp pháp y — bao gồm quá liều gây tử vong, không tử vong và DUID — từ năm 2016 đến 2020 [13]. Xu hướng này trùng khớp với sự gia tăng mạnh của hoạt động buôn bán các chất tương tự fentanyl từ năm 2016, bất chấp các biện pháp kiểm soát pháp lý liên quan [14]. Theo báo cáo của UNODC và Trung tâm Giám sát Ma túy và Nghiện ma túy Châu Âu (EMCDDA) năm 2021, từ năm 2009 đến 2020 đã có hơn 80 (theo UNODC) và 67 (theo EMCDDA) NSO được ghi nhận [15, 16].
Mặc dù opioid truyền thống là morphine, NSO có đặc tính tương tự morphine và bao gồm nhiều nhóm hợp chất đa dạng như:
– Phenethylpiperidines (ví dụ: isobutyrfentanyl)
– Phenylpiperidines (ví dụ: desmethyl-prodine/MPPP)
– Cyclohexylbenzamides (ví dụ: U-47700, AH-7921)
– Diphenethylpiperazines (ví dụ: MT-45)
– Cinnamylpiperazines (ví dụ: bucinnazine/AP-237, 2-methyl AP-237)
– Thiambutenes (ví dụ: piperidylthiambutene)
– Nitrobenzimidazoles (ví dụ: isotonitazene)
Cấu trúc tổng quát của các chất tương tự fentanyl (thường gọi là fentalogs) và các thuốc U-opioid (còn gọi là utopioids) được minh họa trong Hình 1. Được mô tả ngắn gọn dưới đây là các đặc tính dược lý, sự phổ biến và chi tiết phát hiện phân tích cho một số chất NSO phổ biến hơn, bao gồm fentalogs (acetylfentanyl, carfentanil, ocfentanil, furanylfentanyl, butyrylfentanyl) và các chất tương tự không phải fentanyl (U-47700 và MT-45).
Acetylfentanyl là một hợp chất có cấu trúc rất tương tự fentanyl, còn được gọi với tên hóa học N-(1-phenylethylpiperidin-4-yl)-N-phenylacetamide. Hợp chất này có hiệu lực cao hơn heroin khoảng 5–15 lần [17]. Vào năm 2013, acetylfentanyl đã gây ra 10 ca tử vong tại Hoa Kỳ, và từ năm 2015 đến 2016, con số này tăng lên 41 trường hợp tại khu vực Đông Bắc nước Mỹ. Kể từ đó, chất này liên tục được ghi nhận trong các ca quá liều trên khắp nước Mỹ cũng như toàn cầu, bao gồm 9 ca nhập viện tại Thụy Điển (trong đó 1 ca tử vong vào tháng 7 năm 2015) và một trường hợp phơi nhiễm nghiêm trọng tại Nhật Bản trong cùng năm [6, 18–24]. Tại Quận Miami-Dade, Florida, 13 trường hợp dương tính với acetylfentanyl đã được báo cáo trong giai đoạn 2014–2017 [25]. Acetylfentanyl đã được phát hiện với nồng độ 235 ng/mL trong máu dưới đòn, 2400 ng/g trong gan, 131 ng/mL trong dịch kính và 234 ng/mL trong nước tiểu [26]. Các nồng độ tương đối cao này cho thấy khả năng hợp chất được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch. Trong các loạt ca bệnh này, acetylfentanyl thường được phát hiện cùng với fentanyl — do sản xuất bất hợp pháp — hoặc kết hợp với heroin. Sự phổ biến của nó gia tăng một phần nhờ tính dễ sản xuất. Tuy nhiên, do hạn chế trong các phương pháp sàng lọc nhắm mục tiêu acetylfentanyl, số ca tử vong thực tế do hợp chất này có thể đang bị đánh giá thấp [5]. Dù vậy, nhờ sự tương đồng về cấu trúc với fentanyl, khả năng phát hiện acetylfentanyl bằng các kỹ thuật miễn dịch hướng fentanyl thường tốt hơn so với các NSO khác. Các phương pháp phân tích đã được mô tả bao gồm chiết xuất máu bằng kỹ thuật lỏng–lỏng (axit/bazơ) kết hợp với phân tích GC-MS [20]. Ngoài ra, phương pháp chiết pha rắn (SPE) kết hợp LC-MS/MS cũng đã được áp dụng để phát hiện acetylfentanyl và chất chuyển hóa của nó, acetyl norfentanyl, trong nước tiểu [27]. Tuy nhiên, trong kỹ thuật LC-MS, hiện tượng phân mảnh kém có thể dẫn đến tín hiệu ion sản phẩm thấp đáng kể [28]. Các phương pháp phân tích khác đã được áp dụng cho nhóm 24 hợp chất liên quan đến fentanyl — bao gồm acetylfentanyl, p-fluorofentanyl, p-chlorofentanyl, p-tolylfentanyl, alpha-methylacetylfentanyl, alpha-methylfentanyl, N-methylfentanyl, N-benzylfentanyl, 3-methylfentanyl và các NSO tổng hợp chưa được đặt tên khác. Những hợp chất này đã được phân tích bằng nhiều kỹ thuật như sắc ký lớp mỏng (TLC), khối phổ điện tử ion hóa trực tiếp (DIEIMS), sắc ký khí (GC), quang phổ hồng ngoại (IR) và GC-MS trong một nghiên cứu từ năm 1999 [29].
Carfentanil (methyl 1-(2-phenylethyl)-4-(N-propanylanilino)piperidine-4-carboxylate) là một chất chủ vận thụ thể μ-opioid có hiệu lực cực kỳ cao, với khả năng tác động ước tính mạnh hơn morphine khoảng 10.000 lần và mạnh hơn fentanyl khoảng 100 lần [4]. Các báo cáo về ca tử vong liên quan đến carfentanil đã được ghi nhận rộng rãi tại Hoa Kỳ cũng như trên phạm vi quốc tế [30, 31]. Tại Quận Miami-Dade, Florida, từ năm 2014 đến 2017, có khoảng 200 trường hợp xét nghiệm dương tính với carfentanil [25]. Do hiệu lực cực cao của hợp chất này, các phương pháp xét nghiệm cần phải có giới hạn phát hiện cực kỳ nhạy và độ chính xác cao để phát hiện chính xác độc tính của carfentanil và đánh giá tác động của nó trong các trường hợp liên quan. Đáng chú ý, trong một vụ tấn công khủng bố tại Moscow, carfentanil cùng với remifentanil đã được phát hiện trong mẫu sinh học của hai nạn nhân người Anh sống sót [32].
Ocfentanil (N-(2-fluorophenyl)-2-methoxy-N-[1-(2-phenylethyl)-piperidin-4-yl]acetamide) là một hợp chất opioid tổng hợp có hiệu lực cao, với khả năng tác động ước tính mạnh gấp khoảng hai lần so với fentanyl [33]. Một đánh giá toàn diện về ocfentanil và carfentanil đã được trình bày chi tiết trong nghiên cứu năm 2017 của Misailidi và cộng sự [34]. Cùng năm đó, ocfentanil đã được ghi nhận là nguyên nhân gây tử vong trong một trường hợp liên quan đến một thanh niên tại Thụy Sĩ [35].
Một đánh giá quan trọng về furanylfentanyl đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thực hiện vào năm 2017 nhằm ứng phó với sự gia tăng số lượng ca liên quan trong những năm trước đó [36]. Trong vòng ba năm, khoảng 40 trường hợp tử vong sau khi chết đã phát hiện có sự hiện diện của furanylfentanyl [25]. Trong một nghiên cứu trường hợp liên quan đến quá liều furanylfentanyl, nạn nhân tin rằng mình đang sử dụng oxycodone; tuy nhiên, kết quả xét nghiệm cho thấy nồng độ furanylfentanyl và chất chuyển hóa 4-ANPP lần lượt là 1,9 và 4,3 ng/mL trong máu, trong khi không phát hiện oxycodone hoặc các chất chuyển hóa của nó [37]. Một báo cáo khác cũng ghi nhận một trường hợp tử vong có sự hiện diện đồng thời của furanylfentanyl và carfentanil [31].
Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro cho thấy butyrylfentanyl (hay butyrfentanyl) có hiệu lực mạnh hơn morphine khoảng 31 lần [3]. Hai trường hợp tử vong liên quan đến butyrylfentanyl đã được ghi nhận tại bang Virginia, Hoa Kỳ — một trường hợp do butyrylfentanyl và một trường hợp do độc tính hỗn hợp với acetylfentanyl, alprazolam và ethanol [38]. Trong trường hợp tử vong do riêng butyrylfentanyl, nồng độ chất này được ghi nhận lần lượt là 99 ng/mL (máu ngoại vi), 220 ng/mL (máu tim), 32 ng/mL (thủy tinh thể), 590 ng/mL (dịch dạ dày), 260 ng/mL (mật) và 64 ng/mL (nước tiểu). Một trường hợp tử vong do độc tính kết hợp giữa butyrylfentanyl, acetylfentanyl và cocaine đã được ghi nhận tại San Diego, Hoa Kỳ, ở một người đàn ông có tiền sử lạm dụng ma túy tiêm tĩnh mạch, người được phát hiện bất tỉnh trong phòng tắm với các dụng cụ ma túy bên cạnh [39]. Trong trường hợp này, xét nghiệm sàng lọc ELISA cho kết quả dương tính với fentanyl, tuy nhiên, phân tích GC-MS đã xác nhận sự hiện diện của hai hợp chất NSO. Tại Quận Miami-Dade, Florida, ba trường hợp dương tính với butyrylfentanyl đã được ghi nhận trong giai đoạn 2014–2017 [25]. Bốn trường hợp nhiễm độc không gây tử vong liên quan đến butyrylfentanyl và 4-fluorobutyrfentanyl (para-fluorobutyrfentanyl) tại Thụy Điển từ tháng 5 năm 2014 đến tháng 1 năm 2015 đã ghi nhận các triệu chứng điển hình của ngộ độc opioid như mất ý thức, ức chế hô hấp và ngưng thở [40].
Các chất chủ vận thụ thể opioid NSO không thuộc nhóm fentanyl, chẳng hạn như các dẫn xuất N-substituted benzamide và acetamide, được phát triển bởi Công ty Upjohn từ những năm 1970 và thường được gọi là “U-drugs” [1]. Các nghiên cứu in vitro cho thấy U-47700 có hiệu lực gấp 12 lần morphine [3]. Tác động của U-47700 và các dẫn xuất của nó trong cộng đồng người sử dụng ma túy giải trí đã được Baumann và cộng sự mô tả [41]. Trong một báo cáo ca bệnh tại miền Trung California, Hoa Kỳ, ba viên thuốc được cho là Norco thực chất chứa U-47700 và đã được tiêu thụ bởi một phụ nữ 41 tuổi. Người này sau đó xuất hiện các triệu chứng nhiễm độc opioid nhưng đã sống sót sau khi được tiêm naloxone và xuất viện sau 4 giờ [42]. Phát hiện NSO này đã được thực hiện thông qua xét nghiệm nước tiểu bằng phương pháp LC-QTOF/MS, với kết quả dương tính với U-47700 và các phát hiện sơ bộ của N-desmethyl-U-47700 và N,N-didesmethyl-U-47700, sau đó được định lượng chính xác bằng LC-MS/MS ở chế độ MRM [43]. Trong một loạt 19 trường hợp tử vong được điều tra ban đầu do nghi ngờ quá liều opioid, 11 trường hợp dương tính với U-47700, 3 trường hợp với furanylfentanyl và một số trường hợp phát hiện cả hai, được xác định trong máu bằng LC-MS/MS MRM và SPE [44].
NSO MT-45 đã được phát hiện bằng GC-MS trong mẫu sinh học (Papsun et al. 2016). Các nghiên cứu in vitro cho thấy MT-45 có hiệu lực tương đương với morphine [3]. Năm 2020, một opioid benzimidazole mới — etazene (N,N-diethyl-2-ethan-1-amine dihydrochloride) — đã được xác định trong mẫu bị thu giữ và được đặc trưng bằng cấu trúc tinh thể và quang phổ học [45]. Etazene được báo cáo có hiệu lực gấp 70 lần morphine [46]. Trong những năm gần đây, isotonitazene và brorphine đã được phát hiện tại nhiều nơi ở Hoa Kỳ, với các báo cáo cho thấy chúng có hiệu lực tương đương fentanyl [47]. Flunitazene, một NSO mới khác gần đây được ghi nhận, được cho là có hiệu lực thấp hơn fentanyl [48].
Một chế độ xét nghiệm hiệu quả trước tiên phải phát hiện được rằng một NSO đã được sử dụng. Do hiệu lực rất cao của chúng, nhiều chất NSO thường xuất hiện với nồng độ tương đối thấp trong các mẫu sinh học so với các loại ma túy pháp y khác (trong khoảng pg/mL hoặc ngưỡng ng/mL thấp). Trong một nghiên cứu với 355 mẫu máu dương tính với carfentanil trong các trường hợp pháp y, 83,6% mẫu có phát hiện đồng thời fentanyl có hiệu lực cao tương tự, với nồng độ dưới 1 ng/mL [49]. Khi loại trừ các trường hợp có nồng độ dưới giới hạn định lượng 0,10 ng/mL, nồng độ trung bình và trung vị lần lượt là ~0,6 ng/mL và ~0,4 ng/mL, với phạm vi từ <0,1 đến 14 ng/mL. Một nghiên cứu khác trên 160 trường hợp tử vong dương tính với carfentanil cũng cho kết quả nồng độ trung bình và trung vị trong máu lần lượt là ~0,5 ng/mL và ~0,2 ng/mL, với phạm vi từ <0,1 đến 9,2 ng/mL [50]. Do đó, việc sử dụng các thiết bị và kỹ thuật xét nghiệm có độ nhạy rất cao là cần thiết khi điều tra các trường hợp liên quan đến NSO.
Hơn nữa, việc phát hiện sử dụng NSO — thông qua chính hoạt chất hoặc các chất chuyển hóa đặc hiệu và phổ biến của chúng — phải có thể thực hiện được bằng các phương pháp dùng để sàng lọc các hồ sơ pháp y nếu muốn áp dụng xét nghiệm thường quy. Mặc dù các phương pháp miễn dịch (immunoassay) và GC-MS có thể phát hiện một số NSO, những thách thức thực tiễn này có thể được khắc phục hiệu quả hơn bằng các kỹ thuật LC-MS/MS và LC-HRMS.
Tách sắc ký là một thách thức lớn đối với việc phát hiện đặc hiệu các NSO. Nguyên nhân chủ yếu là do sự tương đồng về cấu trúc giữa các đồng phân và các chất tương tự NSO, vốn thường không thể tách biệt rõ ràng trên các chương trình LC phổ biến và tổng quát. Hiện tượng đồng phân là rất phổ biến trong các phương pháp sàng lọc — chẳng hạn như các phương pháp dùng cho sàng lọc không mục tiêu hoặc đa lớp — thường cũng được áp dụng cho các loại ma túy lạm dụng khác. Tuy nhiên, khả năng phân tách tốt hơn để nhận diện đặc hiệu các đồng phân, nhất là đối với các nhóm thế không phải hydro (hetero-substituents) trên khung hydrocacbon thơm, có thể đạt được bằng cách sử dụng các chương trình LC-MS/MS tùy chỉnh. Bên cạnh đó, việc xác định đặc hiệu bằng khối phổ (MS) thông thường cũng có thể gặp khó khăn, đặc biệt khi sử dụng khối phổ danh nghĩa (nominal MS), nơi các ion tiền chất và ion sản phẩm có cùng khối lượng và mô hình phân mảnh tương tự. Trong những trường hợp này, kỹ thuật khối phổ độ phân giải cao (HRMS) có thể hỗ trợ thêm bằng cách cung cấp khả năng phân biệt chính xác hơn giữa các NSO khác nhau.
Các tiêu chuẩn hoặc khuyến nghị nhằm nhắm mục tiêu các NSO trong các trường hợp pháp y hiện vẫn còn rất hạn chế, chủ yếu do tính chất biến động nhanh chóng của thị trường các chất hướng thần mới (NPS) nói chung. Một danh mục các NPS được khuyến nghị thường được cập nhật hàng quý; trong một báo cáo năm 2021, khoảng 25% trong số này được liệt kê là NSO [51]. Danh mục này được chia thành ba tầng, lần lượt gợi ý mức độ ưu tiên: nên đặc biệt xét nghiệm, nên xét nghiệm hoặc nên cân nhắc xét nghiệm NSO trong phạm vi sàng lọc của từng trường hợp. Trước bối cảnh thị trường liên tục biến đổi, các phòng thí nghiệm được khuyến nghị nên cân nhắc mở rộng danh mục NPS xét nghiệm dựa trên xu hướng địa phương, quốc gia và quốc tế. Ví dụ, mặc dù trong quý 2 năm 2021, chương trình đã đặc biệt khuyến nghị xét nghiệm N-pyrrolidino etonitazene, o/m/p-fluorofentanyl, metonitazene, 2-methyl AP-237 và carfentanil như là các NSO cấp 1, thì khả năng protonitazene — hiện đang ở cấp 2 — được nâng cấp lên cấp 1 vào quý 3 có thể xảy ra nếu mức độ sử dụng của nó gia tăng. Những thách thức này cho thấy nhu cầu cấp thiết đối với các phòng thí nghiệm trong việc liên tục trao đổi thông tin về cả xu hướng NSO mới và hiện có.
Ngoài ra, việc thiết lập sự hợp tác chặt chẽ giữa các tổ chức y tế và cơ quan chức năng liên quan đến tịch thu ma túy là điều hết sức quan trọng [52]. Việc gia tăng dữ liệu từ các vụ tịch thu ma túy có thể khiến một khu vực pháp lý phải tăng cường xét nghiệm carfentanil trong các trường hợp pháp y, bao gồm cả các vụ tai nạn liên quan đến lái xe bị ảnh hưởng [11]. Phân tích cả máu và nước tiểu đều có thể phát hiện dễ dàng các thuốc hoạt tính cũng như các chất chuyển hóa của chúng, trong đó mẫu nước tiểu thường có lợi thế hơn trong việc phát hiện các chất chuyển hóa như 4-ANPP.
Việc nhắm mục tiêu nhóm NSO đặt ra nhiều thách thức cho quy trình phân tích truyền thống, do sự gia tăng nhanh chóng về số lượng và sự đa dạng hóa cấu trúc hóa học của chúng, cũng như sự thiếu hụt các tiêu chuẩn tham chiếu có sẵn một cách nhanh chóng trên thị trường [12, 16].
Việc phát hiện các NSO đòi hỏi phải thực hiện các xét nghiệm đặc hiệu, đặc biệt trong các trường hợp pháp y hoặc khi các bác sĩ lâm sàng nghi ngờ ngộ độc opioid, biểu hiện qua các triệu chứng điển hình như ức chế hô hấp, co đồng tử và các dấu hiệu opioid cổ điển khác [53]. Những thông tin liên quan từ điều tra hiện trường hoặc quan sát trong khám nghiệm tử thi cho thấy một sự kiện nhiễm độc opioid nên là yếu tố kích hoạt cho các xét nghiệm chuyên sâu. Tuy nhiên, để tránh thiên lệch, chế độ xét nghiệm này nên được áp dụng nhất quán với ít biến thể nhất có thể giữa các loại trường hợp [54].
Một quy trình xét nghiệm lý tưởng nên bao gồm kết hợp có hệ thống giữa các phương pháp LC-HRMS (sắc ký lỏng khối phổ độ phân giải cao) và LC-MS/MS (sắc ký lỏng khối phổ hai lần). Việc sử dụng các bộ xét nghiệm miễn dịch đã cho thấy những hạn chế đáng kể, khi một nghiên cứu cho thấy một phần ba các trường hợp dương tính với NSO lại trả về kết quả âm tính trong xét nghiệm miễn dịch nhắm mục tiêu fentanyl. Điều này dẫn đến kết luận rằng các kỹ thuật sàng lọc chung như xét nghiệm miễn dịch không hiệu quả trong phát hiện NSO [52, 55].
Trong trường hợp nguồn lực hạn chế, ít nhất các xét nghiệm NSO nên được ưu tiên thực hiện đối với các trường hợp có khả năng liên quan đến ma túy. Cần đảm bảo rằng, bên cạnh việc phát hiện NSO, một phạm vi sàng lọc rộng bao gồm cả các loại thuốc lạm dụng khác — cùng với một chương trình đảm bảo chất lượng đầy đủ — là nền tảng cho một quy trình độc chất học pháp y hiệu quả.
Định lượng NSO cũng đặt ra những thách thức do nguồn lực cần thiết để thực hiện xác nhận đầy đủ đối với những chất hiếm gặp. Điều này còn có thể phức tạp hơn do sự thiếu hụt các chất chuẩn tham chiếu NSO được gắn deuterium (deuterated standards), vốn rất cần thiết để làm chất nội chuẩn cho phép định lượng chính xác. Một giải pháp khả thi cho các phòng thí nghiệm là áp dụng quy trình thêm chuẩn (standard addition), sử dụng chính mẫu án để hiệu chuẩn — giúp giảm thiểu sai lệch do sự khác biệt của nền mẫu giữa mẫu trắng (blank calibrators) và mẫu thật [56, 57]. Mochizuki và cộng sự từng áp dụng kỹ thuật thêm chuẩn (standard addition) này cho acetylfentanyl trong mẫu tử thi [58]. Tuy nhiên, kỹ thuật này yêu cầu sử dụng nhiều mẫu đáng kể hơn, do đó đòi hỏi quy trình xét nghiệm có thể xử lý khối lượng mẫu lớn hoặc yêu cầu một thể tích mẫu đầu vào lớn.
Việc sử dụng đồng thời nhiều chất giữa NSO và các loại thuốc giải trí khác đã được ghi nhận rộng rãi. Một nghiên cứu quy mô lớn trên các mẫu nước tiểu từ bệnh nhân từ một hệ thống chăm sóc sức khỏe lớn đã mô tả sự phổ biến của NSO thông qua quy trình sàng lọc sơ bộ với fentanyl và các opioid, tiếp theo là nhận diện và xác nhận NSO bằng kỹ thuật HPLC-MS/MS [55]. Kết quả cho thấy trong 65% số mẫu, ít nhất một NSO đã được phát hiện và 26% số mẫu dương tính với hai hoặc nhiều chất NSO.
Trong một nghiên cứu pháp y khác, khi các trường hợp dương tính với carfentanil cũng được sàng lọc đối với các loại thuốc khác, gần một nửa số trường hợp cho thấy sự hiện diện của một hoặc nhiều opioid khác — chủ yếu là morphine và/hoặc fentanyl — trong khi heroin (biểu hiện qua chất chuyển hóa 6-monoacetylmorphine) được phát hiện trong 10% số trường hợp [49]. Cũng trong nghiên cứu này, cocaine đã được phát hiện đồng thời trong khoảng một phần ba số trường hợp, cho thấy mô hình sử dụng đồng thời chất kích thích và opioid.
Một nghiên cứu khác trên 160 trường hợp tử vong có liên quan đến carfentanil cho thấy hơn một nửa số trường hợp có sự đồng phát hiện của cocaine và gần một nửa có sự hiện diện của fentanyl cùng với một loạt các loại thuốc lạm dụng khác [50]. Trong một trường hợp quá liều furanylfentanyl, việc sử dụng đa chất đã được xác nhận với sự hiện diện đồng thời của codeine, amphetamine, methamphetamine, delta-9-THC và chất chuyển hóa delta-9-carboxy-THC [37].
Việc chiết xuất NSO từ các ma trận sinh học, cụ thể là máu và nước tiểu, cần đặt trọng tâm vào khả năng thu hồi (recovery) do nồng độ tương đối thấp của các chất này thường gặp trong các trường hợp thực tế. Tuy nhiên, do bản chất luôn thay đổi của các hợp chất NPS, quy trình chiết xuất không nên quá chuyên biệt nhằm bảo đảm các phương pháp sàng lọc tổng quát vẫn có khả năng phát hiện các NSO mới khi chúng xuất hiện trong cộng đồng sử dụng ma túy giải trí — thường xảy ra trước khi các tiêu chuẩn tham chiếu của các hợp chất này được thương mại hóa. Nhìn chung, các kỹ thuật chuẩn bị mẫu thường quy đang được sử dụng trong độc chất học pháp y và các phòng thí nghiệm phân tích có thể được áp dụng hiệu quả cho chiết xuất NSO. Tổng quan về các kỹ thuật chiết xuất đã được áp dụng trong máu và nước tiểu được trình bày trong Bảng 1.
Chiết lỏng-lỏng (LLE) đã được áp dụng phổ biến như một kỹ thuật chuẩn bị mẫu ưu tiên cho phân tích các NSO. Phương pháp này được sử dụng hiệu quả trong cả ba mục đích: sàng lọc, xác nhận và định lượng — áp dụng cho cả GC-MS [21, 22, 26, 31, 38, 39, 59–65] và LC-MS/MS [11, 23]. Đối với phân tích bằng GC-MS, việc dẫn xuất mẫu (derivatization) đôi khi là cần thiết để tăng cường độ bay hơi và độ ổn định của hợp chất mục tiêu [62]. Ví dụ, một kỹ thuật LLE trong môi trường kiềm đã được sử dụng để chiết xuất carfentanil trước khi thực hiện phân tích sàng lọc bằng GC-MS [31]. Trong trường hợp của remifentanil, hợp chất này đã được chiết xuất từ mẫu máu bằng n-butyl chloride, sau đó trải qua kết tủa protein (protein precipitation - PP) bằng methanol, tiếp theo là tái chiết vào môi trường acid, và cuối cùng chiết lại bằng n-butyl chloride pha methanol [59]. Quy trình này cho thấy sự kết hợp linh hoạt giữa LLE và các kỹ thuật hỗ trợ để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi và độ sạch của mẫu.
Chiết pha rắn (SPE) thường mang lại các dịch chiết sạch hơn, phù hợp để đưa trực tiếp vào thiết bị phân tích. Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có tính chọn lọc cao hơn, dẫn đến nguy cơ loại trừ các NSO mới hoặc chưa biết — đặc biệt khi các hợp chất này có sự biến đổi về thành phần hóa học. Với những phân tích mục tiêu như xác nhận xét nghiệm, SPE là một lựa chọn rất hữu ích. Tuy nhiên, trong bối cảnh sàng lọc không mục tiêu, rủi ro loại trừ này nên được cân nhắc và giảm thiểu bằng cách kết hợp với các phương pháp hoặc quy trình khác.
Các ứng dụng cụ thể của SPE trong phân tích NSO đã được ghi nhận như sau:
Những ví dụ trên cho thấy SPE, với lựa chọn vật liệu và chế độ phù hợp, có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng xác nhận mục tiêu, nhưng cũng cần thận trọng khi áp dụng trong các bối cảnh sàng lọc rộng.
Phương pháp kết tủa protein (Protein Precipitation — PP) cũng đã được áp dụng như một kỹ thuật chiết xuất NSO đơn giản và hiệu quả. Trong một nghiên cứu, PP được thực hiện trên 0,1 g máu thông qua quy trình khuấy trộn với acetonitrile, tiếp theo là ly tâm, mang lại giới hạn phát hiện (LOD) đặc biệt nhạy cảm cho các NSO [67]. Tương tự, acrylfentanyl đã được nhắm mục tiêu trong máu bằng một kỹ thuật PP gần giống và sau đó được định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS [68]. Phương pháp PP có ưu điểm lớn ở sự đơn giản, nhanh chóng và yêu cầu ít dung môi, đồng thời phù hợp với các xét nghiệm cần tốc độ cao hoặc xử lý số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, vì mức độ làm sạch mẫu kém hơn LLE hoặc SPE, nên PP thường phù hợp hơn cho các phân tích nhắm mục tiêu khi nền mẫu ít phức tạp hoặc khi thiết bị phân tích có khả năng xử lý tốt tạp chất còn sót lại.
Bảng 1. Các kỹ thuật phân tích bao gồm chuẩn bị mẫu và phân tích dụng cụ để phát hiện các opioid hướng thần mới (NSO) trong các mẫu sinh học
5 Sắc ký tách và kỹ thuật phát hiện
Việc phát hiện các opioid tổng hợp mới (NSO) có thể được thực hiện bằng những kỹ thuật dụng cụ hiện có, vốn thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích độc chất học pháp y. Các kỹ thuật này bao gồm: xét nghiệm miễn dịch, sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) và khối phổ độ phân giải cao (HRMS).
Việc áp dụng HRMS để phát hiện NSO sẽ được trình bày chi tiết hơn trong Chương 9. Ngoài ra, Boronat Ena et al. đã cung cấp một đánh giá toàn diện về việc sử dụng khối phổ ion hóa môi trường xung quanh (ambient ionization mass spectrometry) để phát hiện các chất hướng thần mới (NPS), bao gồm cả NSO [69]. Đáng chú ý, một phương pháp khối phổ phun giấy (Paper Spray Mass Spectrometry — PS-MS) đã được phát triển nhằm phát hiện tám NSO trong nước tiểu [70].
Trong chương này, các phương pháp đã được phát triển để phát hiện NSO trong máu và nước tiểu, dựa trên những kỹ thuật thông dụng tại các phòng thí nghiệm pháp y và lâm sàng, sẽ được mô tả chi tiết dưới đây cũng như được tóm tắt trong Bảng 1.
Trong số các kỹ thuật phân tích, xét nghiệm miễn dịch là phương pháp đơn giản nhất và đã được chứng minh là có thể phát hiện opioid tổng hợp mới (NSO) trong một số trường hợp. Một nghiên cứu toàn diện đã đánh giá 19 bộ xét nghiệm miễn dịch thương mại bằng cách sử dụng 30 chất tương tự fentanyl được chọn do mức độ liên quan của chúng trong giai đoạn 2015–2018 [71]. Cụ thể, nghiên cứu này đã phân tích 9 bộ xét nghiệm dòng chảy bên (lateral flow), 7 xét nghiệm miễn dịch dị thể (heterogeneous immunoassay) và 3 xét nghiệm miễn dịch đồng nhất (homogeneous immunoassay).
Phần lớn các bộ xét nghiệm này được thiết kế để nhắm mục tiêu fentanyl, và tất cả đều phát hiện fentanyl thành công trong 100% trường hợp. Tuy nhiên, khả năng phát hiện các chất tương tự fentanyl của chúng thay đổi đáng kể. Theo thứ tự từ nhóm có hiệu suất kém nhất, các chất sau đây trung bình cho thấy phản ứng chéo dưới 20% với các xét nghiệm miễn dịch nhắm mục tiêu fentanyl:
Từ các kết quả này, có thể đề xuất rằng các chất tương tự fentanyl càng đa dạng về mặt cấu trúc, đặc biệt với các sửa đổi đáng kể trên vòng piperidine, các vòng cồng kềnh, hoặc sự hiện diện của chuỗi alkyl dài trên nhóm N-aryl hoặc alkyl, khu vực amide, được phát hiện kém so với các loại sửa đổi khác.
Ngược lại, một nghiên cứu về phản ứng chéo của bộ xét nghiệm miễn dịch đặc hiệu fentanyl thông qua phương pháp spiking studies (thêm chuẩn vào mẫu) cho thấy acetylfentanyl bắt đầu có phản ứng chéo ở nồng độ 2,5 ng/mL, với mức phản ứng chéo đạt 80% [72]. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác chỉ ra rằng phần lớn NSO không có khả năng phản ứng chéo đủ mức với xét nghiệm sàng lọc fentanyl ELISA. Do đó, phòng thí nghiệm độc chất sau tử vong đã bắt đầu áp dụng phương pháp LC-MS/MS nhắm mục tiêu NSO cho tất cả các trường hợp có tiền sử sử dụng ma túy bất hợp pháp. Trong số này, có 42 trường hợp không phát hiện fentanyl, nhưng lại phát hiện một NSO, trong đó 17 trường hợp là carfentanil [73].
Với sự đa dạng về NSO có sẵn trên thị trường, khả năng phát hiện chúng thông qua xét nghiệm miễn dịch đã bị hạn chế rất nhiều, yêu cầu sử dụng các kỹ thuật nhạy bén hơn để sàng lọc loại thuốc mới này. Một ví dụ về sự hạn chế này đã được báo cáo trong một trường hợp quá liều tai nạn rõ ràng, khi xét nghiệm ELISA trong máu dương tính với fentanyl, nhưng phân tích bằng GC-MS đã xác nhận rằng xét nghiệm chỉ phát hiện acetylfentanyl [19].
Nhiều NSO đã được phát hiện bằng kỹ thuật GC-MS [21, 22, 24, 26, 31, 32, 38, 39, 59–65, 68, 74, 75]. Acrylfentanyl đã được sàng lọc bằng GC-MS với giới hạn phát hiện (LOD) tương đối cao trong mẫu máu, sau quy trình chuẩn bị mẫu SLE có ảnh hưởng [68]. Một đánh giá toàn diện về khả năng phát hiện các chất phân tích NSO bằng kỹ thuật GC-MS đã được thực hiện bởi Valdez [76]. Nhìn chung, yêu cầu giới hạn phát hiện thấp (low LOD) để phát hiện NSO hoạt tính có thể là một thách thức đáng kể đối với việc ứng dụng GC-MS trong lĩnh vực này.
Phương pháp LC-MS/MS để phát hiện NSO đã được sử dụng ngày càng phổ biến trong những năm gần đây so với GC-MS [11, 23, 25, 27, 38, 43, 44, 49, 50, 62, 68, 70, 77]. Tầm quan trọng của xét nghiệm xác nhận đã được ghi nhận khi một nghiên cứu cho thấy rằng hơn một phần ba mẫu bệnh nhân tại bệnh viện — những mẫu đã sàng lọc dương tính với opiate nhưng âm tính với fentanyl — lại phát hiện NSO sau khi thực hiện xét nghiệm xác nhận bằng LC-MS/MS [55]. Một phương pháp với thời gian chạy 11 phút đã thành công trong việc tách 27 chất tương tự fentanyl NSO bằng cách sử dụng cột C18 với hệ đệm amoni thông thường và pha động acetonitrile [25]. Acetylfentanyl và acetyl norfentanyl đã được định lượng và đánh giá trong nước tiểu người bằng LC-MS/MS, sử dụng hai cột bổ trợ (phenyl-hexyl và biphenyl) nhằm tăng tính chọn lọc và phù hợp mục đích [27]. Định lượng acrylfentanyl đã được thực hiện bằng LC-MS/MS trong máu sau khi chuẩn bị mẫu bằng phương pháp PP [68]. Một phương pháp LC-MS/MS nhắm mục tiêu để phát hiện và định lượng U-47700, U-50488 và furanylfentanyl trong máu đã được phát triển, hoạt động ở chế độ MRM dương, sử dụng cột C18 và một chương trình pha động phổ biến [44]. Gần đây, Garneau và cộng sự đã mô tả một quy trình phân tích đã thẩm định và toàn diện để sàng lọc có hệ thống 31 NSO, 22 chất chuyển hóa NSO, cùng các NPS khác [78]. Trong hơn 5.000 trường hợp khám nghiệm tử thi, 5% cho kết quả dương tính với NSO.
