Đang tải...
Phân tích các thuốc trừ sâu phân cực anion trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật sử dụng chiết QuPPe và CE-MS/MS
Tác giả: Ann-Kathrin Schäfer, Walter Vetter & Michelangelo Anastassiades
Tóm tắt: Bài viết này tóm tắt và lược dịch nội dung trong bài nghiên cứu “Analysis of several anionic polar pesticides in food of plant and animal origin using QuPPe extraction and CE-MS/MS determination”. Cung cấp cho bạn đọc hướng tiếp cận mới liên quan tới việc phân tích các thuốc trừ sâu phân cực sử dụng CE-MS/MS. Về người lược dịch tóm tắt, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492
Bấm vào đây để xem bài viết gốc
Bấm vào đây để xem bài lược dịch (đầy đủ hình ảnh)
1. Giới thiệu
Việc giám sát dư lượng glyphosate (Gly), một loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi và chất chuyển hóa chính của nó là axit aminomethylphosphonic (AMPA), trong thực phẩm là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm. Các phương pháp phân tích hiện tại thường gặp phải những hạn chế về độ nhạy, ảnh hưởng nền mẫu và các bước chuẩn bị mẫu tốn thời gian. Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích phát triển và xác nhận một phương pháp điện di mao quản song song (CE-MS/MS) đơn giản hóa để xác định trực tiếp Gly và 13 loại thuốc trừ sâu phân cực anion khác có liên quan, chất chuyển hóa và chất gây ô nhiễm trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau.
2. Phương pháp CE-MS/MS
2.1. Phương pháp xử lý mẫu
Các tiêu chuẩn phân tích nghiêm ngặt đã được duy trì trong suốt nghiên cứu. Các hóa chất và tiêu chuẩn tham khảo có độ tinh khiết cao đã được mua từ các nhà cung cấp có uy tín. Các mẫu đại diện của cả hai loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật, bao gồm: dâu tây, chanh, dưa chuột, gạo, đậu nành, sữa, gan và thận được thu thập từ chợ địa phương, rau cải cầu vồng (Swiss chard) được trồng trong một khu vườn tư nhân, được thu thập và chuẩn bị bằng phương pháp QuPPe đã tối ưu. Mẫu thực vật (PO) và động vật (AO) được chuẩn bị theo phương pháp QuPPe-PO và QuPPe-AO. Trong đó, 5–10 g mẫu đồng nhất được chiết bằng methanol có bổ sung 1% acid formic (MeOHFA), sau đó làm lạnh đông, ly tâm và lọc trước khi phân tích. Với mẫu có hàm lượng protein cao (ngũ cốc, đậu đỗ, hạt dầu, gạo, đậu nành) và mẫu động vật, quá trình chiết bổ sung acid formic để kết tủa protein và pha loãng dịch chiết bằng acetonitril (ACN, 1:1), kết hợp thêm bước dSPE với chất hấp thụ ODS. Ngoài ra, EDTA được bổ sung nhằm tạo phức với ion kim loại, hạn chế tương tác với các chất phân tích dễ tạo phức như glyphosate và AMPA. Ảnh hưởng nền mẫu được đánh giá bằng dịch chiết nền không chứa chất phân tích (trừ vết phosphonate tự nhiên), trong đó gan bò có hàm lượng cao 2-hydroxyethylphosphonic acid (HEPA) nên chất này được loại khỏi quy trình thẩm định.
2.2. Phương pháp CE-MS/MS
Quá trình phân tích CE-MS/MS được thực hiện bằng hệ thống bao gồm thiết bị Sciex CESI 8000 Plus ESI được kết nối với máy đo phổ khối AB Sciex QTrap 5500, cho phép phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất mục tiêu. Ống mao quản tách được sử dụng là cartridge phủ silica OptiMS của Beckman Coulter (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Phân tách được thực hiện với điện áp không đổi 30 kV trong chế độ phân cực ngược trong vòng 16 phút.
Hình 1. Hệ thống điện di mao quản (CE) bao gồm thiết bị CESI 8000 Plus ESI của hãng Sciex (AB Sciex, Framingham, MA, USA) được trang bị bộ nguồn NanoSpray III (AB Sciex, Framingham, MA, USA) và máy khối phổ AB Sciex QTrap 5500 (AB Sciex, Framingham, MA, USA).
Pha điện giải nền (BGE) được sử dụng là hỗn hợp HAc/MeOH/nước (15/20/65, v/v/v, pH 2,2) và dung dịch dẫn điện là HAc/nước (10/90, v/v). Dung dịch dẫn điện này được sử dụng nhằm thiết lập mạch kín với bộ giao diện và không tiếp xúc trực tiếp với các chất phân tích. Dịch chiết mẫu được pha loãng 5 lần với dung dịch MeOHFA/nước (7/3, v/v; trong đó MeOHFA là methanol chứa 1% acid formic), và dung dịch đệm tập trung (dùng cho bước xếp mẫu khi tiêm) là dung dịch NH₄Ac 5 mM (pH 6,7) trong nước.
Riêng với glufosinate, cần sử dụng BGE để pha loãng và không dùng dung dịch đệm tập trung cho cả glufosinate và AMPA. Trước mỗi lần chạy, hệ thống được rửa lần lượt với (i) NaOH 0,1 M, (ii) HCl 0,1 M, (iii) BGE và (iv) dung dịch dẫn điện, mỗi bước kéo dài 2 phút.
Trong phương pháp CE-MS/MS, hai hoặc ba chuyển tiếp khối phổ (mass transitions) và một chuyển tiếp dành cho nội chuẩn đồng vị (IL-IS) tương ứng được ghi nhận đối với mỗi chất phân tích. Nhằm tăng độ nhạy, dwell time được thiết lập ở mức tương đối cao (thường từ 30 đến 50 ms), và không ghi nhận chuyển tiếp thứ hai cho IL-IS.
Bảng 1. Thông tin MRM của các thuốc trừ sâu phân cực
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Tối ưu thành phần BGE
Một loạt các thí nghiệm có hệ thống đã được thực hiện để tối ưu hóa thành phần của chất điện ly nền (BGE) để đạt được sự tách, độ nhạy và hình dạng píc tối ưu. Các nồng độ khác nhau của axit axetic (HAc) (để điều chỉnh pH), cũng được tối ưu. Ngoài ra, việc bổ sung các dung môi hữu cơ như methanol (MeOH) và acetonitrile (ACN) vào BGE đều ảnh hưởng đến hiệu suất ion hóa, cường độ tín hiệu và thời gian di chuyển của chất phân tích. Sự tách điện di của phosphonate khỏi các chất gây nhiễu tiềm năng, chẳng hạn như fosetyl và phosphate, đã được theo dõi để đảm bảo việc định lượng chính xác. Thành phần BGE tối ưu bao gồm 15% axit axetic (HAc) và 20% methanol (MeOH) trong nước, cho khả năng tách, độ nhạy và hình dạng píc đẹp cho hầu hết các chất phân tích được kiểm tra (Hình 2, 3).
Hình 2. Diện tích pic trung bình CE-MS/MS (n = 10) của Gly (a) và chất chuyển hóa chính AMPA (b) ở nồng độ 0,2 µg/ml trong dịch chiết QuPPe từ rau cải cầu vồng (Swiss chard) được pha loãng 5 lần, với các thành phần dung dịch điện ly nền (BGE) khác nhau như thể hiện trong biểu đồ. Việc pha loãng trước khi tiêm mẫu được thực hiện bằng chính BGE tương ứng.
Hình 3. Các điện di đồ CE-MS/MS minh họa của một số chất phân tích (theo chuyển tiếp khối mục tiêu) cũng như của phosphate, sử dụng dung dịch điện ly nền (BGE) là dung dịch HAc 15% trong nước với các tỷ lệ MeOH khác nhau: 0% (a), 5% (b), 10% (c) hoặc 20% (d) (điều kiện cuối cùng). Kết quả thể hiện sự tách biệt của phosphonate khỏi fosetyl, cũng như khỏi ethephon và HEPA (thể hiện trong a–c; phosphate không đo), và sự tách của phosphonate khỏi phosphate (cặp tới hạn, thể hiện trong d). Các dung dịch được bổ sung chuẩn với nồng độ 0,2 µg/ml và được chuẩn bị trong chính BGE tương ứng. Các cửa sổ thời gian di chuyển cho thấy những chất phân tích có sự tách biệt được xem là quan trọng nhất.
2.2. Tối ưu điều kiện tiêm mẫu
Các điều kiện tiêm đã được tối ưu hóa một cách cẩn thận để tăng cường độ nhạy và độ lặp lại của phương pháp CE-MS/MS. Các thông số chính như nồng độ và thể tích của bộ đệm tập trung, cũng như áp suất tiêm và thời gian tiêm, đã được điều chỉnh có hệ thống để thu hẹp dải chất phân tích, tăng cường tín hiệu và giảm thiểu ảnh hưởng nền mẫu. Khi sử dụng dung dịch đệm NH₄Ac 5 mM, tín hiệu Gly đạt diện tích pic trung bình khoảng 3,7 × 10⁶ counts; mức này tăng nhẹ ở 10 mM (4,7 × 10⁶) và 25 mM (4,3 × 10⁶). Tuy nhiên, ở 50 mM, tín hiệu Gly giảm mạnh (~75%), và hiện tượng mất độ nhạy này không phụ thuộc vào thể tích đệm hay mẫu được tiêm. Suy giảm tín hiệu tương tự cũng xuất hiện ở 25 mM khi tăng thể tích tiêm mẫu và đệm (400 psis và 150 psis) (Hình 4). Việc tăng gấp đôi thể tích mẫu tiêm từ 200 psis lên 400 psis giúp tăng diện tích pic gần gấp đôi nhưng gây giãn pic đáng kể, không khắc phục được bằng đệm tập trung. Hiện tượng giãn pic cũng xảy ra khi nồng độ NH₄Ac vượt quá 5 mM hoặc khi tiêm lượng đệm lớn (150 psis thay vì 50 psis). Do đó, điều kiện tối ưu được lựa chọn là tiêm mẫu ở 200 psis, tiêm đệm ở 50 psis, với nồng độ NH₄Ac trong đệm là 5 mM. Thiết lập điều kiện tiêm tối ưu yêu cầu một sự cân bằng giữa việc đưa đủ chất phân tích vào hệ thống và duy trì hình dạng đỉnh và độ phân giải tốt (Hình 5). Khi thử các tổ hợp áp suất và thời gian tiêm khác nhau với cùng tích số áp suất × thời gian = 200 psis, độ lặp lại (RSD) của 12 hợp chất chuẩn trong BGE dao động 4–17% ở điều kiện 5 psi/40 s hoặc 10 psi/20 s. Ngược lại, RSD tăng cao rõ rệt ở áp suất thấp (≥30% tại 2 psi/100 s) hoặc áp suất cao (11–65% tại 20 psi/10 s). Sau khi hiệu chỉnh bằng nội chuẩn đồng vị (IL-IS), RSD trung bình của các chất phân tích nhìn chung ≤10%. Do đó, để tiết kiệm thời gian phân tích và giảm sai số, điều kiện tiêm tối ưu được lựa chọn là 10 psi trong 20 giây (10 psi20 s).
Hình 4. So sánh diện tích pic trung bình CE-MS/MS của Gly được tiêm ở nồng độ 0,2 µg/ml (n = 3) với các nồng độ khác nhau của dung dịch đệm tập trung (focusing buffer) [5 mM, 10 mM, 25 mM hoặc 50 mM NH₄Ac trong nước] và với các thiết lập khác nhau về áp suất cũng như thời gian tiêm (cả trước và sau dịch chiết mẫu): (i) 50 psis (5 psi trong 10 giây) hoặc (ii) 150 psis (10 psi trong 15 giây). Ở phần trên (a), dịch chiết mẫu được tiêm với (iii) 200 psis (10 psi trong 20 giây), và ở phần dưới (b), với (iv) 400 psis (10 psi trong 40 giây). Các dung dịch được chuẩn bị bằng cách pha loãng 5 lần dịch chiết QuPPe từ rau cải cầu vồng (Swiss chard) bằng BGE và bổ sung chuẩn chất phân tích ở nồng độ 0,2 µg/ml.
Hình 5. Giá trị RSD trung bình của 12 hợp chất được thử nghiệm (n = 12), được bổ sung chuẩn ở nồng độ 0,2 µg/ml trong BGE, thu được từ 10 lần tiêm lặp lại cho mỗi điều kiện tiêm. Bốn tổ hợp khác nhau giữa áp suất và thời gian tiêm đều cho tổng giá trị 200 psis: 2 psi100 s, 5 psi40 s, 10 psi20 s và 20 psi*10 s. Phần trên (a) thể hiện kết quả khi không sử dụng IL-IS, trong khi phần dưới (b) thể hiện kết quả khi có sử dụng IL-IS.
2.3. Ảnh hưởng của nền mẫu
Để đánh giá và giảm thiểu ảnh hưởng của nền, các nghiên cứu có hệ thống đã được thực hiện bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn trong cả dung môi tinh khiết (BGE) và chất chiết nền. Cường độ tín hiệu, thời gian di chuyển và hình dạng píc của chất phân tích đã được so sánh để xác định mức độ ảnh hưởng nền mẫu. Hiệu quả của các chất nội chuẩn nội được gắn nhãn đồng vị (IL-IS) trong việc hiệu chỉnh cho các ảnh hưởng nền mẫu cũng được đánh giá. Trong phân tích CE-MS/MS, hiện tượng ức chế tín hiệu, dịch chuyển thời gian di chuyển và biến dạng pic trong dịch chiết chưa pha loãng có thể được giảm đáng kể nhờ pha loãng 5 lần theo phương pháp QuPPe. Kết quả thể hiện việc pha loãng 5 lần giảm ảnh hưởng của nền mẫu đáng kể cho hầu hết các chất, ngoại trừ AMPA và glufosinate. Trong khi pha loãng > 5 lần gây ảnh hưởng đáng kể tới Gly, do đó, pha loãng 5 lần được coi là lựa chọn cân bằng tối ưu (Hình 6, 7). Tuy nhiên, với mẫu có hàm lượng nitrate hoặc chloride cao, cần pha loãng thêm và phân tích lại đối với chlorate và perchlorate. Riêng AMPA và glufosinate, việc pha loãng thêm có lợi khi nồng độ tồn dư đủ cao để vẫn phát hiện được. Dù vậy, mọi sai lệch tín hiệu trong CE-MS/MS đều có thể hiệu chỉnh bằng cách sử dụng nội chuẩn đồng vị (IL-IS). Sự có mặt của các hợp chất nền trong mẫu gây dịch chuyển thời gian di chuyển và hiện tượng fronting ở pic của chlorate và perchlorate (Hình 8). Hai chất này có thời gian di chuyển gần giống với chloride và nitrate – các ion phổ biến trong rau cải cầu vồng và đồng thời được chiết theo phương pháp QuPPe. Trong giai đoạn đầu của quá trình CE, sự đồng di chuyển của lượng lớn chloride và nitrate cản trở quá trình tập trung trước của chlorate và perchlorate trong mao quản, dẫn đến biến dạng pic. Thí nghiệm riêng biệt cũng cho thấy chloride và nitrate ở nồng độ cao (>250 µg/ml) có thể gây hiện tượng giãn pic tương tự. Việc pha loãng mẫu giúp giảm fronting, nhưng vẫn còn rõ rệt ở pha loãng 5 lần và vẫn nhận thấy ở pha loãng 10 lần. Tuy nhiên, chlorate và perchlorate có độ nhạy phát hiện cao nên vẫn có thể chịu được mức pha loãng lớn.
Hình 6. Ví dụ minh họa về ảnh hưởng nền mẫu quan sát được trong CE-MS/MS đối với Gly, Glu và các chất chuyển hóa của chúng (AMPA, NAGly, MPPA và NAGlu), cũng như đối với chlorate trong dịch chiết rau cải cầu vồng (Swiss chard) chưa pha loãng (a) và sau khi pha loãng 5 lần bằng BGE (b). Các cột màu xanh đậm thể hiện ảnh hưởng nền mẫu dựa trên diện tích pic, trong đó “0%” biểu thị sự triệt tiêu hoàn toàn tín hiệu; giá trị ảnh hưởng nền mẫu > 0 biểu thị sự tăng cường tín hiệu. Các điểm màu xanh nhạt thể hiện mức độ sai lệch của tỷ lệ diện tích giữa tín hiệu chất phân tích và tín hiệu IL-IS so với trong dung môi.
Hình 7. Ảnh hưởng nền mẫu đối với một số hợp chất điển hình (AMPA, glufosinate, HEPA và chlorate – những chất chịu ảnh hưởng mạnh nhất bởi sự ức chế ion) được quan sát trong phân tích CE-MS/MS khi tiêm các dịch chiết đã pha loãng 5 lần từ các nền mẫu thực vật và động vật, được thêm chuẩn ở nồng độ 0,2 µg/ml. Trong đó, “0%” biểu thị không có ảnh hưởng nền mẫu, “−100%” biểu thị sự triệt tiêu tín hiệu hoàn toàn, và giá trị ảnh hưởng nền mẫu >0% biểu thị sự tăng cường tín hiệu.
Hình 8. Sự thay đổi về thời gian di chuyển và hình dạng pic (hiện tượng fronting) trong CE-MS/MS của chlorate (ở nồng độ 0,2 µg/ml) trong dịch chiết rau cải cầu vồng (Swiss chard) khi được tiêm sau các mức pha loãng khác nhau: pha loãng 20 lần (a), 10 lần (b), 5 lần (c) và không pha loãng (d).
2.4. Thẩm định phương pháp
Phương pháp CE-MS/MS đã phát triển được thẩm định để đảm bảo tính phù hợp cho việc phân tích định lượng dư lượng thuốc trừ sâu trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau. Các thông số quan trọng được thẩm định, bao gồm độ chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác (độ thu hồi) và độ chính xác (độ lặp lại), đã được đánh giá theo các hướng dẫn đã được thiết lập. Việc xác nhận được thực hiện với hai nhóm chất phân tích, bao gồm Gly, AMPA và một loạt các loại thuốc trừ sâu và chất chuyển hóa có liên quan khác, trong các nền mẫu thực phẩm đại diện như trái cây, rau, sản phẩm từ sữa và nội tạng.
Mặc dù các ảnh hưởng nền mẫu đã được quan sát trong một số nền mẫu thực phẩm, nhưng có thể hiệu chỉnh bằng cách sử dụng các chất nội chuẩn được gắn nhãn đồng vị (IL-IS), dẫn đến độ chính xác và độ chính xác của phân tích được cải thiện. Phương pháp CE-MS/MS phát triển thể hiện hiệu suất ổn định để định lượng hầu hết các chất phân tích được nhắm mục tiêu trong nhiều loại nền mẫu thực phẩm, với độ thu hồi nằm trong phạm vi từ 80% đến 120% và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) nhỏ hơn 20% (Bảng 1, 2). Tuy nhiên, điều quan trọng cần lưu ý là độ nhạy bị hạn chế đã được quan sát đối với một số chất phân tích, đặc biệt là AMPA và glufosinate, trong một số nền mẫu, có thể yêu cầu các bước làm giàu bổ sung để phân tích lượng vết.
Bảng 1. Tỷ lệ thu hồi trung bình (n = 5) và RSD trong phân tích CE-MS/MS đối với các thuốc bảo vệ thực vật anion có độ phân cực cao trong mẫu dâu tây, sữa, gan và đậu nành ở mức nồng độ thấp nhất đã được thẩm định thành công. Các kết quả được tính toán dựa trên hiệu chuẩn nền mẫu có kẹp 2 điểm (2-point bracketing matrix-matched calibration) với việc sử dụng IL-IS. Tất cả các dịch chiết đều được pha loãng 5 lần bằng MeOHFA/H₂O (7/3, v/v), ngoại trừ glufosinate được pha loãng bằng BGE.
Bảng 2. Tỷ lệ thu hồi trung bình (n = 5) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong mẫu chanh và sữa ở mức nồng độ thấp nhất đã được thẩm định thành công. Các kết quả được tính toán dựa trên hiệu chuẩn nền mẫu có kẹp 2 điểm (2-point bracketing matrix-matched calibration) với việc sử dụng chất nội chuẩn đồng vị (IL-IS) (ngoại trừ bromide). Tất cả các dịch chiết đều được pha loãng 5 lần bằng MeOHFA/H₂O (7/3).
4. Kết quả và thảo luận
So với các kỹ thuật phân tích khác như LC-MS/MS và GC-MS/MS, phương pháp CE-MS/MS cung cấp sự thay thế hứa hẹn để phân tích thuốc trừ sâu phân cực, đặc biệt là khi xem xét tính đơn giản, hiệu quả chi phí và hiệu quả giảm thiểu nền của nó. Kết quả nghiên cứu khẳng định CE-MS/MS là một phương pháp hiệu quả cho phân tích định lượng dư lượng thuốc trừ sâu phân cực cao trong các nền mẫu thực phẩm phức tạp sau chiết QuPPe. Việc tối ưu thành phần điện giải nền (BGE) đóng vai trò then chốt trong việc nâng cao độ nhạy và khả năng tách, đặc biệt cho thấy hiệu năng vượt trội so với LC-MS/MS trong việc loại bỏ nhiễu nền đối với phần lớn hợp chất mục tiêu. Mặc dù một số chất như AMPA và glufosinate vẫn còn hạn chế về độ nhạy ở mức dư lượng thấp, các sai số do các thay đổi liên quan tới thông số tiêm mẫu và hiệu ứng nền có thể được hiệu chỉnh hiệu quả bằng nội chuẩn đồng vị (IL-IS). Đặc biệt, ưu điểm về thể tích tiêm siêu nhỏ và tốc độ dòng siêu thấp giúp CE-MS/MS đạt hiệu suất ion hóa cao trong nguồn ESI, đồng thời giảm nguy cơ nhiễm bẩn thiết bị, mở ra triển vọng trở thành công cụ bổ sung quan trọng bên cạnh LC- và IC-MS/MS trong kiểm nghiệm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật phân cực cao.
