Chuyển giao phương pháp từ HPLC sang UPLC: Định lượng hoạt chất Levonorgestrel và Ethinyl Estradiol trong viên nén tránh thai (Phần 2)

Trong phần trước chúng ta đã tìm hiểu về những lợi ích khi chuyển giao phương pháp từ HPLC sang UPLC, bạn đọc xem thêm tại đây:

Chuyển giao phương pháp từ HPLC sang UPLC: Định lượng hoạt chất Levonorgestrel và Ethinyl Estradiol trong viên nén tránh thai (Phần 1)

Hôm nay, nhóm nghiên cứu tiếp tục theo dõi các thông số trong quá trình chạy máy để đánh giá mức độ ổn định của hệ thống UPLC khi phân tích thường quy với lượng mẫu lớn. Nền mẫu khảo sát vẫn là viên nén tránh thai có hoạt chất levonorgestrel và ethinyl estradiol, hệ thống Acquity H-Class UPLC và cột Waters Acquity UPLC BEH C8, 1,7 µm.

Theo dõi các thông số của hệ thống khi sử dụng 2 phương pháp HPLC và UPLC

Mẫu thử xử lý từ viên nén thành phẩm và chuẩn hỗn hợp được tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng để mô phỏng việc sử dụng thường quy trong phòng kiểm nghiệm (QC) điển hình. 5 lần tiêm mẫu chuẩn lặp lại được thực hiện sau 20 lần tiêm mẫu thử và chu kỳ tiêm này được lặp lại liên tục cho đến khi các tiêu chí phù hợp của hệ thống không còn thỏa mãn. Áp suất hệ thống, diện tích pic, thời gian lưu và độ phân giải USP giữa hai pic (levonorgestrel và ethinyl estradiol) đã được theo dõi trong suốt nghiên cứu.

RSD của diện tích pic vẫn duy trì trong phạm vi 2,0% đối với mẫu chuẩn levonorgestrel và ethinyl estradiol, và độ phân giải USP vẫn cao hơn 2,5 trong suốt nghiên cứu, thỏa mãn các tiêu chí phù hợp hệ thống (Hình 1).

Hình 1. Biểu đồ xu hướng của các tiêu chí phù hợp hệ thống với 2200 mẫu tiêm lặp lại, sử dụng phương pháp chuyển giao từ chuyên luận USP.

Áp suất hệ thống tăng dần trong suốt thời gian chạy máy (Hình 2a), và tăng khoảng 36% từ 7200 psi lên 9800 psi trong 1000 mẫu tiêm đầu tiên. Xu hướng tăng áp suất khi sử dụng UPLC được so sánh với phương pháp gốc trong chuyên luận USP chạy trên hệ thống Alliance HPLC sử dụng cột Zorbax C8. Trên hệ thống HPLC (Hình 2b), áp suất ban đầu gần 1350 psi và tăng lên khoảng 2350 psi sau 1000 lần tiêm, tăng 74%.

Hình 2a. Biểu đồ xu hướng áp suất của hệ thống UPLC trong phân tích thường quy với cột Acquity UPLC BEH C8 (phương pháp chuyển giao từ chuyên luận USP).

Hình 2b. Biểu đồ xu hướng áp suất của hệ thống HPLC trong phân tích thường quy với cột Zorbax C8 (phương pháp gốc trong chuyên luận USP).

Cả phương pháp USP trên HPLC và phương pháp chuyển giao UPLC cho levonorgestrel và ethinyl estradiol đều cho thấy sự gia tăng áp suất chậm khi sử dụng các cột khác nhau và các hệ thống khác nhau. Vì lý do này, nguyên nhân của gia tăng áp suất là do mẫu, có thể là bởi khả năng hòa tan kém trong nước của các steroid và tá dược, trong khi pha động chỉ chứa khoảng 50% dung môi hữu cơ. Mặc dù mức tăng áp suất trên hệ thống Acquity H-Class UPLC là đáng kể, nhưng mức tăng tương đối thấp hơn nhiều so với hệ thống HPLC sử dụng cột Zorbax (36% và 74%).

Và mặc dù áp suất tăng trong suốt nghiên cứu nhưng đều nằm trong giới hạn áp suất hoạt động của thiết bị và tất cả các tiêu chí phù hợp của hệ thống đều được đáp ứng.

Việc đánh giá sử dụng thường quy trên hệ thống Acquity H-Class UPLC được dừng ở mức 2200 lần tiêm trong khi vẫn chưa nằm ngoài các tiêu chí phù hợp hệ thống, như trong bảng 1, thể hiện hiệu suất mạnh mẽ đối với levonorgestrel và ethinyl estradiol trên cột Acquity UPLC BEH C8, ngay cả khi tiêm trên 2000 mẫu liên tục.

Bảng 1. Các tiêu chí phù hợp của hệ thống trước và sau 2200 mẫu tiêm lặp lại trong phân tích thường quy, sử dụng phương pháp UPLC chuyển giao từ chuyên luận USP.

Tối ưu phương pháp

Mặc dù phương pháp UPLC đã đáp ứng các tiêu chí phù hợp hệ thống trong hơn 2000 lần tiêm, nhưng sau đó chúng tôi đã thử tối ưu phương pháp nhằm giảm bớt hiện tượng gia tăng áp suất theo thời gian, điều này được cho là do tích tụ mẫu trong khoang hạt nhồi.

Đánh giá sử dụng thường quy thứ hai đã được thực hiện trên một cột Acquity UPLC BEH C8 mới, lần này thêm một bước rửa cột gradient sau mỗi lần rửa giải. Sau 1,5 phút rửa giải đẳng dòng, một bước tăng gradient đến 100% acetonitril trong 0,3 phút được thêm vào, sau đó duy trì 100% acetonitril trong 1 phút (bước rửa) rồi cân bằng lại ở 100% pha động A. Việc thêm bước rửa cột kéo dài chu kỳ tiêm lên 4 phút (bao gồm cả cân bằng lại), nhưng giúp rửa trôi các chất kỵ nước trong mẫu và ngăn chúng tích tụ trên cột, do đó áp suất được ổn định trong suốt quá trình tiêm lặp đi lặp lại (Hình 2c).

Hình 2c. Biểu đồ xu hướng áp suất của hệ thống UPLC trong phân tích thường quy với cột Acquity UPLC BEH C8 (phương pháp chuyển giao từ chuyên luận USP, thêm bước rửa gradient).

Kết luận

Phương pháp trong chuyên luận USP cho viên nén tránh thai đã được chuyển thành công từ HPLC sang UPLC bằng việc sử dụng cột hạt nhồi bé và phần mềm Acquity UPLC Columns Calculator. Phương pháp UPLC nhanh hơn khoảng 85% so với HPLC và giúp tiết kiệm khoảng 92% dung môi tiêu thụ.

Mặc dù bước ly tâm mở rộng rất hữu ích cho chất lượng mẫu tiêm tốt hơn, nhưng nó không làm giảm hiện tượng tăng áp suất hệ thống cả với HPLC và UPLC trong phân tích thường quy. Việc kết hợp rửa gradient sau quá trình rửa giải đẳng dòng giúp giảm sự tích tụ mẫu trên cột, từ đó ổn định áp suất trong quá trình sử dụng thực tế.

Việc sử dụng thường quy phương pháp UPLC được đánh giá trên cột Acquity UPLC BEH C8, 1,7 µm. Sau 2200 lần tiêm, thử nghiệm vẫn vượt qua tất cả các tiêu chí phù hợp của hệ thống theo chuyên luận USP với viên nén levonorgestrel và ethinyl estradiol, chứng tỏ hiệu suất và sự ổn định của hệ thống hoàn toàn phù hợp để phân tích thường quy các công thức thuốc generic.

Ngọc Việt - Tổng hợp