Đang tải...
Sắc ký lỏng (LC) được định nghĩa vào đầu những năm 1900 bởi công trình của nhà thực vật học Nga, Mikhail S. Tswett. Nghiên cứu tiên phong của ông tập trung vào việc tách các hợp chất [sắc tố lá], chiết xuất từ thực vật bằng cách sử dụng một dung môi, trong cột được nhồi bằng các hạt.
Tswett lấp đầy một cột thủy tinh với các hạt. Hai vật liệu cụ thể mà ông thấy hữu dụng là bột phấn [calcium carbonate] và alumina. Ông đổ mẫu [chiết xuất lá cây đồng nhất trong dung môi] vào cột và để nó chảy vào những khe trống. Tiếp đến dung môi tinh khiết. Khi mẫu chảy qua cột theo trọng lực, có thể thấy các dải màu khác nhau được tách biệt bởi vì một số thành phần chuyển động nhanh hơn các thành phần khác. Ông nghĩ các dải màu được tách ra có thể coi như những hợp chất khác nhau chứa trong mẫu ban đầu. Ông đã tách các hợp chất này dựa trên sự hấp dẫn hóa học khác nhau của mỗi chất đối với hạt nhồi. Các hợp chất tương tác mạnh với hạt nhồi thì chảy chậm lại, trong khi các hợp chất khác có lực tương tác mạnh hơn với dung môi chuyển động nhanh hơn. Quá trình này có thể được mô tả như sau: các hợp chất chứa trong mẫu phân bố hoặc phân chia khác nhau giữa dung môi chuyển động (được gọi là pha động) và hạt nhồi (được gọi là pha tĩnh). Điều này làm cho mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo ra sự phân tách.
Tswett gọi chromatography [từ chữ Hy lạp chroma, có nghĩa là màu sắc, và graph, có nghĩa là viết — theo nghĩa đen, là viết màu] cho thí nghiệm đầy màu sắc của mình. [Kỳ lạ thay, trong tiếng Nga Tswett cũng có nghĩa là màu sắc]. Ngày nay, sắc ký lỏng, dưới nhiều hình thức khác nhau, đã trở thành một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích.
Hình A: Thử nghiệm của Tswett
Sắc ký lỏng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật phẳng [Kỹ thuật 1 và 2] hoặc kỹ thuật cột [Kỹ thuật 3]. Kỹ thuật cột trong sắc ký lỏng là mạnh mẽ nhất và sử dụng được với lượng mẫu lớn nhất. Trong mọi trường hợp, mẫu đầu tiên phải được hòa tan trong một chất lỏng sau đó được chuyển vào (hoặc lên) thiết bị sắc ký.
Kỹ thuật 1. Mẫu được chấm lên bản mỏng, một lớp mỏng các hạt sắc ký [pha tĩnh] cố định trên bề mặt tấm nền [Hình B]. Cạnh dưới của tấm được đặt trong dung môi. Dòng chảy được tạo ra bởi hiện tượng mao dẫn khi dung môi [pha động] khuếch tán vào lớp hạt khô và di chuyển ngược lên tấm nền. Kỹ thuật này được gọi là sắc ký lớp mỏng hoặc TLC.
Hình B: Sắc ký lớp mỏng
Lưu ý rằng mẫu màu đen là hỗn hợp của chất màu thực phẩm FD&C màu vàng, đỏ và xanh đã được tách bằng sắc ký.
Kỹ thuật 2. Trong hình C, các mẫu được chấm trên giấy [pha tĩnh]. Dung môi [pha động] sau đó được thêm vào tâm vết chấm để tạo ra dòng chảy hướng ra ngoài tâm. Đây là một dạng sắc ký giấy. [Sắc ký giấy cổ điển được thực hiện theo cách tương tự như của TLC với dòng chảy tuyến tính]. Trong hình trên, mẫu FD&C màu đen tương tự được thực hiện trên giấy.
Hình C: Sắc ký giấy
Chú ý sự khác biệt về khả năng tách của loại giấy này khi so sánh với bản mỏng TLC. Vòng màu xanh lá cây chỉ ra rằng giấy không thể tách các chất màu vàng và màu xanh ra khỏi nhau, nhưng có thể tách chúng ra khỏi chất màu đỏ. Trong ảnh thứ ba, mẫu màu xanh lá cây được tạo thành từ chất màu vàng và màu xanh. Như bạn dự đoán, giấy không thể tách rời hai loại chất màu. Hình thứ hai, mẫu màu tím được tạo thành từ chất màu đỏ và màu xanh, chúng được tách biệt tốt.
Kỹ thuật 3. Phương pháp này mạnh mẽ nhất, mẫu đi qua một cột hoặc một cartridge chứa các hạt nhồi thích hợp [pha tĩnh]. Những hạt này được gọi là vật liệu nhồi sắc ký. Dung môi [pha động] được chảy qua thiết bị. Trong chiết pha rắn [SPE], mẫu được nạp vào cartridge và dòng dung môi đưa mẫu chảy xuống. Như trong thử nghiệm của Tswett, các hợp chất trong mẫu được phân tách bằng cách di chuyển với các tốc độ khác nhau qua thiết bị. Ở đây mẫu màu đen được nạp vào cartridge, mỗi bước sử dụng một dung môi khác nhau để đạt sự phân tách.
Hình D-1: Sắc ký cột – Chiết pha rắn [SPE]
Khi sử dụng dạng cartridge, có một số cách để tăng lưu lượng chảy. Trọng lực hoặc chân không có thể được sử dụng cho các cột không chịu được áp lực. Thông thường, các hạt nhồi trong trường hợp này có đường kính lớn [> 50 micron] để ít cản trở dòng chảy. Cột thủy tinh dạng mở [thử nghiệm của Tswett] là một ví dụ về điều này. Ngoài ra, các cột nhựa nhỏ hình ống tiêm, có thể được lấp đầy bằng hạt nhồi và được sử dụng để chuẩn bị mẫu. Kỹ thuật này được gọi là chiết pha rắn [SPE]. Ở đây, thiết bị sắc ký, được gọi là cartridge, được sử dụng để làm sạch một mẫu rất phức tạp có sự hỗ trợ của chân không trước khi nó được phân tích thêm.
Hạt kích thước nhỏ hơn [<10 micron] được sử dụng để cải thiện khả năng tách. Tuy nhiên, các hạt nhỏ hơn cản trở mạnh dòng chảy, do đó cần áp lực cao hơn để tạo ra tốc độ dòng dung môi mong muốn. Do đó thiết bị và cột được thiết kế để chịu được áp lực cao. Khi áp suất từ trung bình đến cao được sử dụng để bơm dung môi qua cột sắc ký, kỹ thuật này được gọi là HPLC.
Từ viết tắt HPLC, được đưa ra bởi Giáo sư Csaba Horváth cho bài báo Pittcon năm 1970, ban đầu chỉ ra rằng áp suất cao được sử dụng để tạo ra dòng chảy qua cột sắc ký. Ban đầu, máy bơm chỉ có áp suất 500 psi [35 bar]. Điều này được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao [high pressure liquid chromatography], hoặc HPLC. Đầu những năm 1970 đã chứng kiến một bước tiến lớn trong công nghệ. Những thiết bị HPLC mới có thể tạo ra áp suất tới 6.000 psi [400 bar] và kết hợp các kim tiêm mẫu, đầu dò và cột cải tiến. HPLC thực sự được sử dụng nhiều vào giữa những năm 1970. Với những tiến bộ liên tục về hiệu suất trong thời gian này [hạt nhồi nhỏ hơn, thậm chí áp suất cao hơn], HPLC từ viết tắt vẫn giữ nguyên, nhưng tên đã được thay đổi thành sắc ký lỏng hiệu năng cao [high performance liquid chromatography].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích. Nó có khả năng tách, định danh và định lượng các hợp chất có mặt trong bất kỳ mẫu nào có thể hòa tan trong chất lỏng. Ngày nay, các hợp chất có nồng độ vết như phần nghìn tỷ [ppt] có thể dễ dàng được phát hiện. HPLC có thể được áp dụng cho bất kỳ mẫu nào, chẳng hạn như dược phẩm, thực phẩm, chế phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm, môi trường, pháp y và hóa chất công nghiệp.
Hình D-2: Cột HPLC
Năm 2004, công nghệ thiết bị và công nghệ cột đã được cải tiến để gia tăng đáng kể độ phân giải, tốc độ và độ nhạy cho sắc ký lỏng. Cột với các hạt nhỏ hơn [1,7 micron] và thiết bị có khả năng bơm pha động ở 15.000 psi [1.000 bar] giúp đạt đến mức hiệu suất mới. Hệ thống mới được tạo ra để thực hiện sắc ký lỏng siêu hiệu năng, hiện nay được gọi là công nghệ UPLC.
Ngày nay những nghiên cứu cơ bản đang được tiến hành bởi các nhà khoa học với cột có kích thước hạt nhỏ hơn 1 micron và thiết bị có khả năng hoạt động ở 100.000 psi [6.800 bar]. Điều này cho ta một cái nhìn thoáng qua về những gì có thể mong đợi trong tương lai.
Nguồn: waters.com
![Webinar [SCIEX]: Đặc trưng của thuốc liên hợp kháng thể - dược phẩm bằng công nghệ thế hệ mới](/Upload/z6003661655288_1a912c7c73f0995f9617257a2f58c95e.jpg)
