Ứng dụng của sắc ký lỏng tương tác ưa nước (HILIC) trong phân tích aminoglycosid

Giới thiệu về HILIC

Nhìn lại lịch sử của sắc ký lỏng (LC), các hệ thống tiên phong được vận hành ở chế độ pha thông thường (NPLC) tức là pha tĩnh phân cực. Tuy nhiên, pha tĩnh như vậy thể hiện tính không đồng nhất dẫn đến các yếu tố duy trì cực đại và không tuyến tính với nồng độ chất phân tích khác nhau. Việc rửa giải trong NPLC đã được thực hiện bằng dung môi hữu cơ không phân cực. Một số biến thể như sử dụng dung môi isohydric đã được thử, nhưng phương pháp này được cho là khá hiếm và không mang lại hiệu quả tốt trong thời gian dài hơn. Sự phát triển của các pha tĩnh cho sắc ký được thúc đẩy bởi các nghiên cứu dược phẩm về phân vùng nước / octanol, dẫn đến các hệ thống pha đảo (RP) được thiết lập tốt hiện nay. Các pha tĩnh cầu nối octadecyl cho phép phân tách hiệu quả các chất phân tích trong một phạm vi rộng của phân cực và cân bằng cột nhanh. Việc thiếu lưu giữ các hợp chất ưa nước cao với các nhóm chức ion hóa đã được bổ sung bằng sắc ký trao đổi ion hoặc ghép cặp ion trên các cột RP. Tuy nhiên, đối với một nhóm lớn các hợp chất ưa nước mạnh mà không thể bị ion hóa trong dung dịch, không thể có được sự lưu giữ ở cả hai pha tĩnh. Vấn đề đôi khi đã được khắc phục trong GC bằng cách tạo dẫn xuất, và gần đây, trong LC bằng cách phát triển sắc ký tương tác ưa nước (HILIC).

Thuật ngữ liên quan đến hydro hydrophilic đề cập đến ái lực với nước. Khái niệm về HILIC như sau: pha tĩnh phân cực giữ lại các chất phân tích phân cực được rửa giải bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ (thường là acetonitril (ACN)) và nước. HILIC là chế độ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thay thế để tách các hợp chất phân cực. HILIC đã được báo cáo là một biến thể của NPLC, nhưng cơ chế tách trong HILIC phức tạp hơn so với NPLC. Mặc dù từ viết tắt HILIC lần đầu tiên được đề xuất bởi Alpert vào năm 1990, số lượng ấn phẩm trên HILIC đã tăng đáng kể kể từ năm 2003 như được chỉ ra ở nơi khác và như được nêu trong bài đánh giá của Hemström và Irgum. Alpert lưu ý rằng các nhóm cơ bản tích điện trong chất tan dẫn đến tính ưa nước và lưu giữ rõ rệt. Ông cho rằng cơ chế lưu giữ bao gồm chủ yếu là phân vùng giữa pha động số lượng lớn và một lớp pha động được làm giàu bằng nước, một phần bất động trong pha tĩnh. Hemström và Irgum đã kết luận rằng cả sự hấp phụ và cơ chế phân vùng đều góp phần duy trì trong HILIC. Các mô hình mô tả cơ chế lưu giữ trong HILIC. Giống như NPLC, HILIC sử dụng các pha tĩnh phân cực truyền thống như silica, amino hoặc cyano, nhưng pha động được sử dụng tương tự như các pha được sử dụng trong chế độ RPLC.

Ban đầu, HILIC được áp dụng chủ yếu để xác định carbohydrat, axit amin và peptid. Kể từ đó, HILIC đã được áp dụng thành công cho tất cả các loại phân tách sắc ký lỏng, bao gồm các phân tử nhỏ, hợp chất dược phẩm, chất chuyển hóa, thuốc lạm dụng, độc tố, carbohydrat, oligosacarit, axit amin, peptid và protein. Sự quan tâm đến kỹ thuật HILIC trong những năm qua đã được thúc đẩy bởi nhu cầu ngày càng tăng đối với việc phân tích thuốc phân cực, chất chuyển hóa và các hợp chất quan trọng về mặt sinh học trong proteomics, glycomics và phân tích lâm sàng. HILIC cũng cho phép phân tích các chất tích điện, như trong sắc ký ion (IC). Một lý do khác cho sự phổ biến ngày càng tăng của HILIC là sự phù hợp tuyệt vời của nó để ghép với phép đo phổ khối (MS). Hình. 1 cho thấy HILIC bổ sung cho các lĩnh vực sắc ký khác và mở rộng phạm vi các tùy chọn tách.

Hình 1. Mối quan hệ giữa HILIC với pha thường và pha đảo

Nhìn chung, các ưu điểm của HILIC đã được tóm tắt như sau: (i) có thể thu được hình dạng đỉnh tốt cho các bazơ, (ii) Độ nhạy của MS được tăng cường do hàm lượng chất hữu cơ cao trong pha động và hiệu quả phun cao và kỹ thuật khử màu, (iii) tiêm trực tiếp thường có thể được tạo ra từ các chất chiết tách từ các cột chiết pha rắn C18 với dung môi có hàm lượng chất hữu cơ cao, vì đây là các dung môi yếu trong HILIC, (iv) thứ tự rửa giải các chất hòa tan là khác nhau và nhìn chung ngược lại với sự phân tách RP, (v) khả năng lưu giữ tốt các hợp chất phân cực thu được trong HILIC, trong khi khả năng lưu giữ rất kém thường thu được trong RPLC và (vi) tốc độ dòng chảy cao hơn có thể do hàm lượng chất hữu cơ cao và do đó thấp hơn Độ nhớt của các pha di động điển hình. Ngoài ra, các mẫu phân cực luôn cho thấy độ hòa tan tốt trong nước có chứa pha động được sử dụng trong HILIC, giúp khắc phục nhược điểm của độ hòa tan kém thường gặp trong NPLC. Thuốc thử cặp ion không bắt buộc trong HILIC và có thể kết hợp thuận tiện với MS, đặc biệt là ở chế độ ion hóa phun điện tử (ESI). Trái ngược với RPLC, HILIC rửa giải gradient bắt đầu bằng dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp và rửa giải các chất phân tích phân cực bằng cách tăng hàm lượng nước phân cực. Các ưu điểm khác của HILIC đã xuất hiện gần đây, bao gồm việc sử dụng các cột dài để đạt được sự phân tách hiệu quả cao, khả năng tải vượt trội so với RP cho các chất tan cơ bản tích điện và khả năng phân tích rất nhanh do các đặc tính chuyển khối tốt của các cột được vận hành trong các pha di động có độ nhớt thấp hơn nhiều so với thường được sử dụng trong RPLC.

Tuy nhiên, HILIC cũng có một số nhược điểm so với phân tách RP bao gồm: (i) cơ chế phân tách hiện tại chưa được hiểu rõ hơn so với RPLC. Do đó, có thể khó dự đoán ảnh hưởng của sự thay đổi các điều kiện đến kết quả phân tách, (ii) kỹ thuật này không có khả năng áp dụng rộng rãi của RPLC. Các phân tích trung tính và không phân cực thường cho thấy rất ít sự lưu giữ. Ngoài ra, các chất phân tích axit bị ion hóa (các ion tích điện âm) có thể cho thấy sự lưu giữ ít do sự đẩy lùi ion từ các nhóm silanol cột tích điện âm trên một số cột dựa trên silica và (iii) HILIC là một kỹ thuật tiềm năng nhưng ít thân thiện với môi trường hơn RPLC vì nó tiêu thụ thể tích dung môi hữu cơ lớn hơn nhiều.

2. Sử dụng HILIC để phân tích kháng sinh Aminoglycosid

Aminoglycoside (AG) rất phân cực và thiếu nhiễm sắc thể (ví dụ như neomycin B), khiến chúng khó phân tách bằng cách sử dụng RPLC thông thường với phát hiện UV. Các nhà nghiên cứu đã khắc phục vấn đề này bằng cách sử dụng các tác nhân tạo dẫn xuất và thuốc thử cặp ion để phát hiện. Tuy nhiên, các bước tạo dẫn xuất làm cho quá trình phân tích tốn nhiều thời gian hơn và thường gặp các vấn đề về định lượng. HILIC kết hợp với MS đã nhận được sự chú ý lớn cho phân tích AGs vì không cần tạo dẫn xuất hoặc bổ sung các thuốc thử ghép ion.

HILIC đã được sử dụng rộng rãi để phân tích aminoglycosid trong các thành phần mẫu khác nhau (Bảng 1), bao gồm cơ và thận [3], [12] , huyết tương [11], huyết thanh [8], [9], phân [10], táo [1], sữa [2], mật ong [6]và mẫu hỗn hợp [5]. Kumar và cộng sự [6] đã báo cáo một phương pháp HILIC để phân tích và khảo sát kỹ thuật sắc ký trên một số AG (streptomycin, dihydrostreptomycin, Spectinomycin, apramycin, neomycin, paramomycin, kanamycin A và gentamicin). Các pha tĩnh với ba trạng thái điện tích khác nhau, chẳng hạn như silica trần (âm tính), aminopropyl (dương tính), amid (trung tính) và ZIC HILIC, đã được chọn cho các thí nghiệm sàng lọc. Thành phần pha động (pH và cường độ ion) và nhiệt độ cột cũng đã được nghiên cứu ZIC HILIC đáp ứng sự phân tách và độ nhạy phù hợp. Phương pháp này được áp dụng trực tiếp để phân tích dư lượng AG trong mật ong. Dựa trên những kết quả nghiên cứu này, Kumar et al. [7] tiếp tục nghiên cứu dư lượng AG trong các mẫu thận từ động vật sản xuất thực phẩm và trong các mẫu mật ong bằng ZIC HILIC kết hợp với máy phân tích khối khối tứ cực chập ba. Giới hạn định lượng (LOQ) dao động từ 2 đến 125 µg/kg trong mật ong và 25 đến 264 µg/kg trong các mẫu thận, thấp hơn giới hạn dư lượng tối đa (MRL) đã được thiết lập. Ngoài ra trong các nghiên cứu khác, các pha tĩnh của ZIC HILIC đã được tìm thấy để thực hiện tốt [3; 6-9]. Sáu AGs (amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, paromomycin và tobramycin) đã được định lượng đồng thời bằng ZIC HILIC kết hợp với phát hiện ESI-MS / MS trong huyết thanh người [6]. Tương tự, neomycin được định lượng bằng LC-MS / MS sử dụng HILIC trong huyết thanh người [7]. Phân tích neomycin, apramycin và kanamycin có thể bằng ZIC HILIC với phát hiện MS và cùng một cột cũng được sử dụng thành công trong một nghiên cứu cơ chế lưu giữ (Hình 2) [4]. Một phần quan trọng trong cơ chế tách là một lớp nước, được xây dựng khi cân bằng pha tĩnh với pha động. Một chất phân tích phân cực sẽ trải qua phân vùng ưa nước giữa lớp nước và pha động. Ngoài ra, một chất phân tích tích điện có thể có các tương tác tĩnh điện yếu và / hoặc mạnh (cả lực hút và lực đẩy) bởi các nhóm ưa ion, góp phần rất lớn vào sự phân tách. Do các AG có tương tác tĩnh điện mạnh với pha tĩnh ưa ion, nên cần sử dụng axit formic và nồng độ đệm cao trong pha động để đạt được hiệu suất sắc ký tốt.

Nhiều dư lượng kháng sinh AG trong khối cơ, thận của bò và lợn được định lượng bằng LC-MS / MS [3]. Một cột ZIC-HILIC đã được sử dụng để phân tách sắc ký. Phương pháp này được phát hiện là độ nhạy và đặc hiệu cao cho việc định lượng đồng thời các AG với LOQ là 25 ng/g đối với gentamicin, 50 ng/g đối với Spectinomycin, dihydrostreptomycin, kanamycin và apramycin; và 100 ng/g đối với streptomycin và neomycin, tất cả đều nằm dưới giới hạn dư lượng tối đa theo Hệ thống tiêu chuẩn của Codex [3].

Streptomycin (STR) và dihydrostreptomycin (DHSTR) là hai trong số các kháng sinh AG được sử dụng phổ biến nhất trong y học thú y. Gremilogianni et al. [2] so sánh HILIC với sắc ký cặp ion (IPC) để xác định dư lượng STR và DHSTR trong sữa. Việc tách HILIC được thực hiện bằng cột HILIC Fortis dựa trên silica. Độ nhạy của phương pháp HILIC lớn hơn phương thức IPC cho cả STR và DHSTR.

Phương pháp HILIC-MS / MS để phát hiện và định lượng Spectinomycin và lincomycin từ phân lỏng và nước tiểu ra được mô tả bởi Peru et al. [10]. Việc phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Altima HP HILIC dựa trên silica. Phát hiện MS được thực hiện bằng giao diện ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI) trong chế độ ion dương theo dõi nhiều phản ứng (MRM). Họ phát hiện ra rằng phương pháp này rất nhạy cảm đối với việc định lượng kháng sinh và HILIC cung cấp khả năng lưu giữ và tách tuyệt vời của Spectinomycin và lincomycin khỏi các thành phần mẫu can thiệp mà không cần thuốc thử ghép ion.

Phương pháp LC-MS / MS tự động sử dụng cột CAPCELL PAK ST HILIC để định lượng đồng thời 15 dư lượng AG trong cơ, gan (lợn, gà và gia súc), thận (lợn và gia súc), sữa bò và trứng gà đã được báo cáo ở các nơi khác nhau [12]. 15 AG bao gồm streptomycin (STREP), amikacin (AMIKA), hygromycin B (HYGRO), dihydrostreptomycin (DIHY), netilmicin (NETIL), kasugamycin (KASUG), kanamycin B (K) gentamicin C1 (GENT), apramycin (APRA), paromomycin (PAROM), tobramycin (TOBRA), ribostamycin (RIBOS) và neomycin B (NEOM). Khả năng phát hiện trong phương pháp này dao động từ 10 đến 50 µg/kg. Sắc ký MRM LC-MS / MS của chiết xuất gan bò có thêm các các AG này được thể hiện trong hình 5. Báo cáo kết luận rằng phương pháp LC-MS / MS có thể được áp dụng để phân tích dấu vết của các chất gây ô nhiễm AG đa thành phần trong nền mẫu phức tạp. Phương pháp HILIC đã cho phép lưu giữ và phân tách dư lượng AG phù hợp.

3. Kết luận

Trong những năm gần đây, sự phân tách HILIC đã nhận được sự chú ý lớn hơn chủ yếu do tính linh hoạt của chúng trong việc phân tích thuốc cực, chất chuyển hóa, các hợp chất quan trọng về mặt sinh học, vv trong các thành phần mẫu phức tạp có nguồn gốc khác nhau. Do tính chất ưa nước của hầu hết các loại kháng sinh, HILIC phù hợp hơn cho việc phân tích kháng sinh đặc biệt là Aminoglycosid so với phương pháp sắc ký RP truyền thống. Có rất nhiều loại cột HILIC có sẵn trên thị trường với các giai đoạn văn phòng phẩm đa dạng. Tuy nhiên, các pha tĩnh cố định silica, zwitterionic và aminopropyl được sử dụng phổ biến nhất. ESI-MS / MS là phương pháp phát hiện phổ biến nhất được sử dụng trong phân tách HILIC của hầu hết các loại kháng sinh. Sự phát triển không ngừng của các phương pháp HILIC mới kết hợp với các hệ thống phát hiện mạnh hơn có thể sẽ làm tăng việc sử dụng và phổ biến của nó trong phân tích kháng sinh trong tương lai.

Nguồn: TS. Đào Thị Cẩm MinhKhoa Dược – Trường ĐH Y Dược huế