Phân tích hiển vi của phấn hoa trong mật ong

Việc kiểm tra vi hiển vi đối với mật ong và phấn hoa (một lĩnh vực nghiên cứu được gọi là melissopalynology – phân tích phấn hoa mật ong) cho phép các nhà nghiên cứu xác định loại phấn hoa, phân biệt mật ong hoa và mật ong dịch ngọt (honeydew honey), đồng cũng như phát hiện bất kỳ sự nhiễm tạp nào.    

Giới thiệu 
Nghiên cứu về phấn hoa, còn được gọi là phấn hoa học (palynology), đã trở nên quan trọng hơn trong những năm gần đây: 

• Khoảng 30 triệu người bị dị ứng ở Đức được thông báo về nồng độ phấn hoa trong không khí dự kiến (Hình 1) bởi Quỹ Dịch vụ Thông tin Phấn hoa Đức (PID). 

• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực khảo cổ học, pháp y và địa lý có thể đưa ra những kết luận giá trị từ những phát hiện về phấn hoa. 

• Việc thụ phấn cho đất nông nghiệp có thể được xác minh bằng cách phân tích phấn hoa, từ đó sớm triển khai hành động và ngăn ngừa tổn thất kinh tế. 

• Phân tích phấn hoa trong mật ong được thực hiện trong phạm vi bảo vệ người tiêu dùng. Mục tiêu là xác định chất lượng, nguồn gốc và độ tinh khiết của nguồn mật ong. Bằng cách này, người tiêu dùng được bảo vệ khỏi những tuyên bố sai sự thật cũng như bất kỳ sự nhiễm tạp hoặc hàm lượng chất gây dị ứng nào trong các sản phẩm mật ong. 

Hình 1: Lịch phấn hoa (Tháng 1 đến tháng 9 cho các loại cây: Cây phỉ, Cây tống quán sủi, Cây đu, Cây liễu, Cây dương, Cây tần bì, Cây bạch dương, Cây trăn, Cây tiêu huyền, Cây sồi, Cây dẻ gai, Cỏ, Cây mã đề, Cây chua me đất, Cây lúa mạch đen, Cây tầm ma, Cây ngải cứu). 

Hình 2: Phấn hoa của cây liễu tơ (pussy willow). 

Ghi chú ứng dụng này dành riêng cho điểm cuối cùng này – cụ thể là melissopalynology. 

Chức năng và cấu trúc của phấn hoa 
Hạt phấn hoa, thường được gọi là phấn hoa, là các giao tử đực của thực vật. 

Nhị hoa là cơ quan đực của hoa (Hình 3). Nó bao gồm chỉ nhị và bao phấn. Bao phấn thường chứa bốn túi phấn kết nối với nhau, nơi các hạt phấn được hình thành. Khi phấn hoa đã chín, các túi phấn rách ra và giải phóng chúng. Vì thực vật nở hoa vào những thời điểm khác nhau, phấn hoa của chúng chỉ có thể được tìm thấy trong không khí và mật ong vào những thời điểm cụ thể. 

Vỏ ngoài của hạt phấn được gọi là exine. Nó bảo vệ hạt phấn chống lại sự phân hủy do các yếu tố sinh học và hóa học, giúp nó rất bền bỉ. Do đó, phấn hoa có thể tồn tại và được phát hiện trong một thời gian dài trong mật ong. Các yếu tố điêu khắc đặc biệt (như gai, mụn cóc, que, chùy hoặc rãnh) nằm ở lớp vỏ ngoài. Hầu hết các hạt phấn đều có thêm các đặc điểm đặc trưng, chẳng hạn như các nếp gấp mầm hoặc lỗ mầm, về mặt lý thuyết cho phép định danh loại phấn hoa. Đây là những lỗ nhỏ trên vách phấn hoa, từ đó ống phấn có thể mọc ra khỏi hạt phấn. Lớp bên trong, được gọi là intine, có thể được tìm thấy dưới lớp exine. Nó bao bọc nguyên sinh chất tế bào với các thành phần tế bào chức năng (Hình 4). 

Tùy thuộc vào chức năng, hạt phấn có thể khô hoặc dính. Trong khi thực vật thụ phấn nhờ gió thường có phấn hoa khô, các hạt phấn dính nhắm vào côn trùng như một phương tiện vận chuyển (Hình 5). Độ dính đến từ một lớp phủ lipid gốc dầu, được gọi là pollenkitt, đảm bảo sự bám dính vào ong bắp cày và ong mật. 

Hình 3: Cấu trúc của hoa (Cánh hoa, Nhị hoa, Lá noãn, Lá đài, Đế hoa, Cuống hoa). 

 
Hình 4: Cấu trúc phấn hoa (Lớp vỏ ngoài - Exine, Lớp vỏ trong - Intine, Hạt tinh bột, Tế bào sinh sản với nhân, Nhân của tế bào sinh sản, Lỗ mầm - Aperture, Màng tế bào sinh dưỡng, Tế bào chất sinh dưỡng). 

 
Hình 5: Phấn hoa bám vào ong một cách hoàn hảo nhờ vào lớp pollenkitt (Ảnh: József Szabó / pixabay.com). 

Từ ong đến mật ong 
Mật ong là một sản phẩm tự nhiên và đã là một thực phẩm quý giá trong hàng ngàn năm. Quy định về Mật ong của Đức định nghĩa mật ong là một chất ngọt tự nhiên, được tạo ra bởi loài ong. Ong thu thập mật hoa hoặc các dịch tiết khác của thực vật, thêm các chất đặc hiệu của riêng chúng như enzyme, và lưu trữ tất cả trong tổ ong (Hình 6). 

Do đó, mật ong chủ yếu bao gồm các loại đường khác nhau (fructose và glucose), axit hữu cơ, enzyme và các hạt rắn được hấp thụ trong khi thu thập mật hoa. Phấn hoa chủ yếu xâm nhập vào mật hoa trong khi ong mật thu thập nó từ hoa. Phấn hoa bám vào chân và bộ lông của ong, và do đó tìm đường vào tổ ong. 

Các loại mật ong khác nhau 
Trong mật ong đơn hoa, chẳng hạn như mật ong hoa cải, phần lớn chỉ có thể phát hiện được một loại phấn hoa. Mật ong nguyên chất không pha trộn được tạo ra khi một đàn ong chủ yếu tập trung vào một loại cây khi thu thập nguyên liệu thô. 

Ngược lại, nhiều loại phấn hoa khác nhau có thể được tìm thấy trong mật ong rừng và mật ong hoa. 

Mật ong hoa có hàm lượng glucose cao hơn. So với fructose, glucose có độ hòa tan trong nước thấp hơn, đó là lý do tại sao mật ong hoa kết tinh nhanh chóng. Cấu trúc tinh thể có thể được nhìn thấy rõ ràng dưới kính hiển vi. 

Trong mật ong rừng, hàm lượng fructose thường cao hơn, điều đó có nghĩa là mật ong rừng thường duy trì ở trạng thái lỏng. Ngoài phấn hoa, các hạt khác – chẳng hạn như bào tử nấm, tảo và nấm men – có thể được tìm thấy trong mật ong rừng. Chúng chủ yếu xâm nhập vào mật ong thông qua dịch ngọt. 

Mật ong được sản xuất như thế nào? 

1. Ong mật thu thập mật hoa ngọt ngào và dịch ngọt trong diều mật (túi mật) của chúng. 

2. Ong thợ bay về tổ với khoảng 30 mg mật hoa hoặc dịch ngọt. 

3. Mật hoa trong diều mật được chuyển từ con ong này sang con ong khác. Mỗi con ong thêm các enzyme nội sinh và tách nước. 

4. Nguyên liệu thô liên tục được kéo giãn và làm khô giữa miệng và vòi. 

5. Sau khi lưu trữ, ong liên tục kiểm tra xem mật đã đạt chưa. 

6. Khi mật ong có độ đặc phù hợp, ong đóng kín tổ ong bằng nắp sáp kín khí. 

7. Mật ong thường được thu hoạch vào nửa sau của tháng Bảy. 

8. Các lỗ tổ ong được lấy ra khỏi tổ, và lớp sáp được loại bỏ. Mật ong sau đó có thể được chiết xuất từ tổ bằng cách quay ly tâm. 

9. Để ngăn mật ong kết tinh, nó được khuấy bởi người nuôi ong. 

10. Cuối cùng, mật ong được đóng vào lọ. 

Hình 6: Từ loài ong đến mật ong. 

Dịch ngọt thường không có nguồn gốc từ mật hoa mà từ các dịch tiết khác của thực vật và côn trùng. 

Phân tích mật ong – Tại sao phân tích mật ong là cần thiết 
Dưới đây bạn sẽ tìm thấy một số dữ liệu và sự kiện làm nổi bật lý do tại sao phân tích mật ong là cần thiết và hữu ích. 
Tổng sản lượng mật ong toàn thế giới đạt hơn 1,8 triệu tấn. Sau Trung Quốc, Liên minh Châu Âu là nhà sản xuất mật ong lớn thứ hai thế giới với khoảng 250.000 tấn mỗi năm, tiếp theo là Thổ Nhĩ Kỳ, Argentina và Iran. Ở EU, có khoảng 650.000 người nuôi ong và hơn 18 triệu tổ ong. May mắn thay, số lượng người nuôi ong và tổ ong ở EU đang tăng lên. Với hơn 125.000 người nuôi ong, Đức đang dẫn đầu. Tuy nhiên, mật ong sản xuất tại Đức không thể đáp ứng đủ nhu cầu địa phương. Mật ong rất phổ biến ở Đức, đó là lý do tại sao khoảng 70% được nhập khẩu từ các nước EU và ngoài EU. Gần 40% mật ong được nhập khẩu (chủ yếu từ Trung Quốc, Ukraine và Mỹ Latinh) để đáp ứng nhu cầu về mật ong ở EU. 

Mật ong do đó đại diện cho một yếu tố kinh tế có liên quan – một yếu tố thường xuyên nằm trong tâm điểm của các vụ bê bối gian lận thực phẩm trên toàn thế giới. Gian lận thực phẩm không phải là mới, nhưng cường độ và tần suất của nó đang gia tăng. Có những báo cáo về dầu ô liu siêu nguyên chất giả và việc cố ý pha trộn các loại gia vị cũng như sản xuất mật ong giả. Tổng cộng về thiệt hại kinh tế do gian lận thực phẩm ước tính khoảng 40 tỷ USD mỗi năm. Theo một số nguồn tin, mật ong giả là loại gian lận thực phẩm phổ biến nhất. 

Mật ong giả rõ ràng là một ngành kinh doanh lớn. Mật ong là một trong những thực phẩm bị dán nhãn sai thường xuyên nhất trên thế giới. Vì mật ong được tuyên bố là một sản phẩm tự nhiên nguyên chất, các chất phụ gia không được phép sử dụng. Ví dụ, việc cho ong ăn đường hoặc xi-rô để sản xuất mật ong là bị cấm. Tương tự, không chất nào vốn có trong mật ong bị loại bỏ, và không có chất nào khác được thêm vào. Nhãn mật ong, chẳng hạn như mật ong hoa cải hoặc mật ong hoa hướng dương, chỉ có thể được sử dụng nếu mật ong đó chủ yếu (>50%) có nguồn gốc từ hoa hoặc cây được nêu tên và có các đặc điểm vi hiển vi, cảm quan và lý-hóa nhất định (nguồn: Quy định Mật ong của Đức). 

Trong thực tế, mật ong – đặc biệt là mật ong nhập khẩu – thường được trộn với các chất làm ngọt rẻ tiền như siro  gạo hoặc siro ngô. Quá trình này, trong đó mật ong không nguyên chất được giả mạo thành mật ong thật, được gọi là "rửa mật ong". Nguồn gốc địa lý cũng thường bị che giấu để tránh thuế nhập khẩu hoặc thuế trừng phạt. Trong trường hợp này, các sản phẩm được nhập khẩu thông qua các nước thứ ba và đưa vào nước mục tiêu dưới một "lá cờ giả". Thường thì phấn hoa bị loại bỏ khỏi mật ong thông qua lọc, nhằm làm cho việc phân tích phấn hoa vi hiển vi để truy xuất nguồn gốc quốc gia trở nên khó khăn hơn. 

Ví dụ, các chuyên gia an toàn và sức khỏe thực phẩm đã kiểm tra một phần lớn mật ong bán tại Hoa Kỳ và thấy rằng mật ong chủ yếu bao gồm chất làm ngọt, đường chưa tinh chế, xi-rô ngô và chỉ một lượng nhỏ mật ong thật. Một vụ bê bối gần đây hơn đã bị phanh phui vào giữa năm 2018, khi các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng gần một nửa số mật ong bán trên các kệ siêu thị ở Úc là mật ong giả. Mật ong nhập khẩu từ Châu Á thậm chí còn chứa độc tố kim loại và kháng sinh. 

Gian lận mật ong rõ ràng là một hiện tượng toàn thế giới – điều không ngạc nhiên trong bối cảnh toàn cầu hóa ngày càng tiến triển. 

Tiêu chuẩn hóa 
Đây là lý do đủ để thường xuyên phân tích các đặc tính của mật ong về mặt chất lượng và số lượng dựa trên các tiêu chuẩn cụ thể, đặc biệt là liên quan đến an toàn thực phẩm, và từ đó kiểm tra tính chính xác của các chỉ dẫn về nguồn gốc thực vật hoặc khu vực. Các tổ chức và chính quyền trên toàn thế giới đang giải quyết vấn đề này. Điều này đang được thực hiện ở Hoa Kỳ, ví dụ, bởi Liên đoàn Nuôi ong Hoa Kỳ. Họ đã yêu cầu FDA tạo ra một "tiêu chuẩn nhận dạng" cho mật ong, về cơ bản là một định nghĩa chi tiết chỉ định các tiêu chuẩn pháp lý. 

Tại Đức, các sản phẩm nuôi ong cũng phải tuân thủ các yêu cầu và kiểm tra nghiêm ngặt. Các thông số kỹ thuật tương ứng có thể được tìm thấy trong DIN 10760 và Quy định Mật ong của Đức. Theo Quy định Mật ong ban hành bởi Bộ Bảo vệ Người tiêu dùng, Thực phẩm và Nông nghiệp Liên bang Đức, mật ong phải trải qua một số phân tích nhất định để có thông tin về các thành phần cũng như nguồn gốc địa lý và thực vật. Tại Đức, các Viện Nghiên cứu Ong (Länderinstitute für Bienenkunde, LIB) chịu trách nhiệm về các yêu cầu và kiểm tra nghiêm ngặt này. Các phân tích phấn hoa về chất lượng và số lượng được thực hiện cho mục đích này rất tốn kém và mất thời gian, vì nhân viên được đào tạo cần phải đếm và định danh phấn hoa trong các mẫu một cách thủ công. 

Cách thức phân tích phấn hoa 
Các loại phân tích khác nhau cần thiết để đặc trưng đầy đủ cho mật ong được chia thành ba loại: 

• Phân tích cảm quan: Bao gồm việc kiểm tra màu sắc, mùi và vị. 

• Phân tích hóa-lý: Phân tích các khía cạnh như hàm lượng nước, hoạt độ enzyme invertase và phổ đường theo các tiêu chuẩn DIN tương ứng. 

• Phân tích vi hiển vi: Chủ yếu bao gồm phân tích phấn hoa và cung cấp thêm thông tin chi tiết về các thành phần trầm tích, bao gồm cả nấm men và tinh bột. 

Trung bình, 1g mật ong chứa 5.000 hạt phấn. Điều này chiếm một tỷ lệ trung bình khoảng 0,02g phấn hoa trên 100g mật ong, tương đương 0,02%. Kích thước nhỏ của phấn hoa (chủ yếu từ 20 đến 80 µm) đồng nghĩa với việc cần phải phân tích bằng kính hiển vi. 

Việc kiểm tra mật ong bằng kính hiển vi cũng cung cấp cái nhìn sâu sắc về các hạt chứa bên trong và mức độ kết tinh của các loại mật ong khác nhau. 

Phân tích phấn hoa diễn ra theo tiêu chuẩn DIN 10760 và cho phép đánh giá nguồn gốc địa lý và thực vật của mật ong. Việc xác định nguồn gốc địa lý đặc biệt quan trọng đối với mật ong nhập khẩu – không chỉ để phát hiện hàng giả mà còn cho các chỉ định nhất định như đặc điểm chất lượng "Mật ong thật của Đức" (Real German Honey). Các sản phẩm muốn có nhãn này không được chứa bất kỳ phấn hoa nào có nguồn gốc từ bên ngoài nước Đức. Việc định danh thực vật xác minh độ tinh khiết của nguồn hoa của mật ong. Một tỷ lệ phấn hoa nhất định từ một loài hoa phải được phát hiện để mật ong nhận được chỉ định tương ứng. Ví dụ, mật ong keo (acacia honey) chỉ cần được cấu tạo từ 20% phấn hoa cây keo (robinia). Ngược lại, mật ong hoa cải phải được cấu tạo từ ít nhất 80% phấn hoa hoa cải. Các giới hạn tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào mức độ phổ biến của một loại phấn hoa trong tự nhiên. Phấn hoa cây keo vốn dĩ ít được đại diện, điều này giải thích cho giới hạn tần suất phấn hoa dường như thấp là 20%. Đối với phân tích phấn hoa mật ong, việc phát hiện phấn hoa sơ cấp và phấn hoa thứ cấp là mối quan tâm hàng đầu. 

Sự thật về loài ong: 

• Để sản xuất 1 kg mật ong, ong mật phải thu thập khoảng 3 kg mật hoa. Điều này tương ứng với khoảng 900.000 đến 6.000.000 lượt hạ cánh trên hoa. 

• Ong thụ phấn cho khoảng 71 trên 100 cây trồng, bao phủ 90% nhu cầu thực phẩm toàn thế giới. 

• Năm 2017, có khoảng 870.000 đàn ong ở Đức. Kể từ năm 1985, khoảng 25% đàn ong mật đã bị tuyệt chủng ở Trung Âu. 

• Ong thợ bay một quãng đường 8.000 km trong suốt cuộc đời của chúng. Chúng thụ phấn cho khoảng 4.000 bông hoa mỗi ngày. 

• Nông nghiệp hiện đại là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm quần thể côn trùng trên toàn thế giới (sử dụng thuốc trừ sâu (12,6%) và phân bón (10,1%)). 

• Một đàn ong cần khoảng 70 kg mật ong để cung cấp năng lượng và khoảng 25 kg phấn hoa để cung cấp protein – người nuôi ong chỉ lấy phần ong thu thập vượt quá mức này, khoảng 20 đến 30 kg. 

Chuẩn bị mẫu mật ong ly tâm 
Mật ong được cân dựa trên độ nhớt của nó và hòa tan trong nước cất. Theo quy tắc chung, mỗi 10g mật ong cần 20ml nước cất. Dung dịch được ly tâm trong khoảng 15 phút với tốc độ 3.500 vòng/phút. Khoảng 2 x 2 cm phần cặn sau đó được đưa lên lam kính bằng ống nhỏ giọt. Lượng này tương ứng với thể tích tối đa là 0,5 ml. Để đánh giá nhanh, mép của lamen được đặt vào mép của giọt nước và hạ xuống từ từ. Để kiểm tra lâu dài hoặc lưu trữ mẫu, bước cuối cùng được thay thế bằng cách làm khô mẫu trên bàn nhiệt và phủ bằng gelatin. Sau đó, các mẫu mật ong khác nhau có thể được kiểm tra dưới kính hiển vi. 

Phân tích vi hiển vi 
Để định danh phấn hoa, một kính hiển vi quang học (thường là kính hiển vi soi thẳng với độ tương phản trường sáng) được sử dụng. Hình dạng, kích thước và cấu trúc bề mặt của các hạt phấn rất khác nhau tùy thuộc vào loài hoặc họ, điều này có ý nghĩa quan trọng đối với việc phân biệt các loại phấn hoa. Do đó, kiểm tra vi hiển vi hạt phấn thường có thể được sử dụng để xác định loại cây liên quan hoặc ít nhất là họ của nó. Một thách thức ở đây là các yếu tố điêu khắc và các đặc điểm khác như lỗ mầm xuất hiện rất khác nhau dưới kính hiển vi quang học tùy thuộc vào vị trí của chúng trong mẫu. Vì lý do này, mẫu phải được kiểm tra ở các mức tiêu cự khác nhau để có được hình ảnh đầy đủ về hạt phấn. Trong trường hợp mẫu mật ong, phấn hoa thường được kiểm tra và định danh với độ phóng đại 400x trong ba đến năm thị trường đầu tiên. Sau khi phấn hoa đã được định danh, việc đếm có thể bắt đầu. Cho mục đích này, độ phóng đại 200x hoặc thậm chí 100x thường được sử dụng. 

Trong trường hợp phấn hoa lạ hoặc gặp khó khăn trong định danh, có thể sử dụng độ phóng đại cao hơn với vật kính 63x hoặc 100x. Tiêu chuẩn DIN quy định rằng phải đếm ít nhất 500 hạt phấn, theo đó sự phân bố tỷ lệ phần trăm thường được tính toán sau mỗi 100 hạt phấn. Nếu sự biến động trong phân bố quá lớn, có thể đếm thêm phấn hoa nếu cần thiết. Điều quan trọng là phải đếm và định danh phấn hoa mà không có mật hoa riêng biệt. Hơn nữa, hàm lượng nấm men và tinh bột cũng được xác định, cũng như ghi chú các cấu trúc khác hoặc sự nhiễm tạp. Đây là một quy trình tốn thời gian: Phân tích vi hiển vi của phấn hoa có thể dễ dàng mất từ một đến hai giờ. 

Thiết bị kính hiển vi khuyến nghị 

• ZEISS Axiolab 5 

• Vật kính: Plan Neofluar: 10x, 20x, 40x, 63x 

• Lưu trữ tài liệu: ZEISS Axiocam 208 color, ZEISS Labscope 

Tóm tắt 
Mật ong là một sản phẩm tự nhiên. Tính chính xác của các chỉ dẫn về nguồn gốc thực vật và khu vực có thể được xác minh bằng cách phân tích phấn hoa vì mật ong chứa một tỷ lệ phấn hoa – có thể nhìn thấy trong các mẫu vi hiển vi – phản ánh các hoạt động thu thập của ong. Sự phân biệt cũng có thể được thực hiện giữa mật ong hoa và mật ong dịch ngọt bằng cách phân tích vi hiển vi. Kính hiển vi cũng tiết lộ các tạp chất, chẳng hạn như quá nhiều nấm men hoặc tinh bột, vốn không thuộc về mật ong. Bước đầu tiên của phân tích vi hiển vi là xác định tất cả phấn hoa có mặt và chỉ định loại cây nguồn gốc của nó. Các nhà nghiên cứu cần có kiến thức toàn diện về thực vật và phấn hoa của chúng để có thể phân biệt các loại khác nhau. Các bộ sưu tập phấn hoa nội bộ hoặc cơ sở dữ liệu phấn hoa có thể được sử dụng cho mục đích so sánh. Trong bước thứ hai, phấn hoa được đếm và xác định tỷ lệ phần trăm của các loại phấn hoa khác nhau. Điều này được sử dụng để xác định độ tinh khiết của nguồn mật ong. 

Hình 8: Phấn hoa của cây đoạn (linden), được chụp bằng ZEISS Axiolab 5 ở chế độ trường sáng, vật kính: 40x. Thước đo: 20 µm.