Phân tích Testosterone, Androstenedione và Dehydroepiandrosterone Sulfate trong huyết thanh

Dominic Foley, Michelle Wills, and Lisa Calton 

Waters Corporation, Wilmslow, UK

GIỚI THIỆU

Testosterone, androstenedione, và dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) là các androgenic steroid hormone liên quan tới việc điều chỉnh các đặc tính về giới tính. Phân tích các cấu trúc tương tự nhau của steroid hormones bởi LC-MS/MS cung cấp ba mức độ chọn lọc; Chuẩn bị mẫu, sắc ký lỏng, và nhận biết bằng khối phổ.

Chúng tôi giới thiệu tới các bạn một giải pháp đó là sử dụng công nghệ chiết pha rắn Oasis PRiME HLB µElution để chiết testosterone, và rostenedione, và  DHEAS từ huyết thanh, quá trình được làm tự động trên máy Tecan Freedom Evo 100/4 Liquid Handler. Phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng ACQUITY UPLC I-Class kết nối khối phổ Xevo TQD (Hình 1), Cột ACQUITY UPLC HSS T3. Thêm vào đó, chúng tôi đã đánh giá bằng ngoại kiểm cho các mẫu testosterone, androstenedione, và  DHEAS để đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích testosterone, androstenedione, và  DHEAS cho nghiên cứu lâm sàng.

Hình 1. Hệ thống Waters ACQUITY UPLC I-Class và Xevo TQD.

ĐIỀU KIỆN CHẠY

LC 

System:    ACQUITY UPLC I-Class (FTN)
Needle:    30 µL
Column:    ACQUITY UPLC HSS T3
    2.1 x 50 mm, 1.8 µm
    (Waters P/N 186003538)

            
Pre-column:    ACQUITY UPLC HSS T3
    VanGuard 2.1 x 5 mm 1.8 µm
    (Waters P/N 186003976)

            
Mobile phase A:    Water with 2 mM ammonium acetate
    + 0.1% formic acid
Mobile phase B:    Methanol with 2 mM ammonium acetate

+    0.1% formic acid Needle wash solvent:   80% methanol(aq)

Purge solvent:    40% methanol(aq)

Column temp.:    50 °C

Injection volume:    15 µL

Flow rate:    0.60 mL/min

Gradient:    See Table 1

Run time:    4.7 minutes

MS conditions

System:    Xevo TQD

Resolution:    MS1 (0.75 FWHM)

MS2 (0.75 FWHM)

Acquisition mode:    Multiple Reaction Monitoring (MRM)

(see Table 2 for details)

Polarity:    ESI positive/negative

Capillary:    0.4 kV

Source temp.:    150 °C

Desolvation temp.:    450 °C

Inter-scan delay:    0.01 seconds

Inter-channel delay:    0.02 seconds

Data management

MassLynx v4.1 Software with TargetLynx Application Manager

CHUẨN BỊ MẪU

Các chuẩn Testosterone, androstenedione, và DHEAS được mua từ Sigma Aldrich (Poole, UK). Calibrators được chuẩn bị trong nền mẫu MSG4000 được mua từ Golden West Biologicals (Temecula, CA). Testosterone và androstenedione calibrators được chuẩn bị trong khoảng nồng độ 0.17–69 nmol/L, (QCs) kiểm soát tại 

0.52 nmol/L, 5.2 nmol/L và 35 nmol/L. DHEAS calibrators đưucọ chuẩn bị trong khoảng  0.14–54 µmol/L với kiểm soát QCs tại  0.41 µmol/L, 4.1 µmol/L, và 27 µmol/L.

CHIẾT MẪU

Qúa trình được thực hiện trên máy chiết tự động Tecan Freedom Evo 100/4 Liquid Handler. Lấy 100 µL mẫu; 25 µL của 28 nmol/L testosterone-13C3 /androstenedione-13C3, và  1.4 µmol/L DHEAS-2H5 , 200 µL methanol và  thêm 550 µL nước. Mĩ mẫu và ly tâm 4000 Rpm trong 5 phút.

Lấy  (600 µL)  phần dung dịch và load lên tấm Oasis PRiME HLB µElution (Waters P/N 186008052) và tạo độ chân không thấp(100 mbar). Rửa tạo bằng 200 µL 0.1% (v/v) formic acid và  35% (v/v) methanol(aq) , sau đó rửa tiếp bằng 200 µL 0.1% (v/v) ammonia trong 35% (v/v) methanol(aq). Chấtp hân tích được rửa giải bằng 45 µL of methanol, sau đó là 55 µL nước.

KẾT QUẢ

Không có nhiễu nền nào được quan sát thấy tai thời gian lưu của các chất  testosterone, androstenedione, và DHEAS và các cấu trúc tương tự của chúng (11-deoxycortisol, 21-deoxycortisol,

21-hydroxyprogesterone, 17-hydroxyprogesterone, corticosterone, cortisol, DHEA, và  dihydrotestosterone). Phân tách các đồng vị của chúng trong tại nồng độ >1 µmol/L.

Không có sự nhiễm chéo xảy ra.

Hình 2: Sắc ký đồ các chất cần phân tích

Hình 3: Các thông số kết quả về độ chính xác, lặp lại, ảnh hưởng của nền mẫu, tuyến tính

KẾT LUẬN

Một phương pháp phân tích có độn hạy và chọn lọc trong nghiên cứu lâm sàng đã được phát triển để phân tích testosterone, androstenedione, và DHEAS trong huyết thanh

Chỉ sử dụng thể tích mẫu là 100 ul, phương pháp mang tới độ nhạy đủ để phân tích testosterone, androstenedione,
và DHEAS tại nồng độ thấp.

Các quá trình phân tích được tự động hóa giúp cải thiện quy trình làm việc và giảm thời gian chuẩn bị mẫu, giảm thiểu các sai sót do người làm.

Thanglong Instruments (Theo Waters.com)