Tổng quan về phân tích thuốc hạ cholesterol máu trong các mẫu sinh học

Tổng quan về phân tích thuốc hạ cholesterol máu trong các mẫu sinh học

Tác giả: Hung Le

Giới thiệu: Bài viết này trình bày tổng quan sơ bộ một số phương pháp xử lý mẫu và phân tích một số thuốc hạ cholesterol máu và trình bày quan điểm của tác giả liên quan tới việc phân tích các chất liên quan. Về tác giả, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492

1. Giới thiệu

Các thuốc hạ cholesterol máu, hay còn gọi là thuốc hạ lipid máu, đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát tình trạng tăng cholesterol máu và giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh tim mạch. Các thuốc này hoạt động thông qua nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm ức chế quá trình tổng hợp cholesterol ở gan (như nhóm statin), giảm hấp thụ cholesterol ở ruột (như ezetimibe), hoặc tăng đào thải cholesterol (như các resin gắn acid mật). Nhóm statin, bao gồm atorvastatin, simvastatin, rosuvastatin, là những thuốc được sử dụng phổ biến nhất, có hiệu quả cao trong việc giảm cholesterol LDL ("cholesterol xấu"). Ezetimibe thường được phối hợp với statin để tăng cường hiệu quả giảm cholesterol, đặc biệt trong trường hợp statin đơn thuần không đủ hiệu quả. Ngoài ra, còn có các thuốc khác như fibrates, PCSK9 inhibitors, và acid béo omega-3, được sử dụng tùy theo tình trạng bệnh và các yếu tố nguy cơ của từng bệnh nhân. Việc lựa chọn và sử dụng thuốc hạ cholesterol cần được cá nhân hóa, dựa trên đánh giá tổng thể của bác sĩ, kết hợp với chế độ ăn uống và lối sống lành mạnh để đạt được hiệu quả điều trị tối ưu. Việc phân tích các thuốc hạ cholesterol đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chứng tăng cholesterol máu và giảm nguy cơ bệnh tim mạch. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) đã nổi lên như một công cụ mạnh mẽ để phân tích các thuốc này nhờ độ nhạy, độ chọn lọc và tính linh hoạt cao. Kỹ thuật phân tích này cho phép định lượng chính xác các thuốc này và các chất chuyển hóa của chúng trong các nền sinh học phức tạp, chẳng hạn như huyết tương hoặc huyết thanh. Bài tổng quan này cung cấp cái nhìn tổng quan về các khía cạnh khác nhau của phân tích LC-MS các thuốc hạ cholesterol, bao gồm chuẩn bị mẫu, phương pháp phân tích, những phát hiện chính, thách thức và các triển vọng trong tương lai.

2. Xử lý mẫu

Chuẩn bị mẫu là một bước quan trọng trong phân tích LC-MS, nhằm mục đích tách/làm giàu thuốc mục tiêu khỏi nền sinh học phức tạp và loại bỏ các hợp chất gây nhiễu. Các phương pháp phổ biến để chiết xuất thuốc hạ cholesterol bao gồm LLE và chiết pha rắn (SPE). LLE sử dụng độ hòa tan khác nhau của các chất phân tích trong hai dung môi không trộn lẫn, trong khi SPE hấp phụ chọn lọc các chất phân tích lên pha rắn. Với LLE, methyl tert-butyl ether hoặc ethyl acetate được thêm vào mẫu huyết tương, mẫu sau đó được lắc và ly tâm để hình thành sự tách giữa pha nước và pha hữu cơ. Trong đó các chất phân tích sẽ được phân bố vào pha hữu cơ và được thu thập để tiếp túc các quá trình xử lý mẫu tiếp theo nếu cần. Với SPE, đầu tiên mẫu được đưa lên cột SPE sau khi đã cân bằng/hoạt hoá cột, sau đó cột được rửa bằng các dung môi phù hợp để loại bỏ các các chất cản trở. Cuối cùng chất phân tích được rửa giải khỏi cột và thu lại để làm khô hoặc tái hoà tan trước khi phân tích. Ngoài ra một phương pháp đơn giản hơn là sử dụng kết tủa protein sử dụng dung dịch hữu cơ, tuy đơn giản và chi phí thấp kỹ thuật này có những hạn chế nhất định liên quan tới độ sạch của mẫu được xử lý, đặc biệt là với những mẫu có nền mẫu phức tạp. Thông thường mẫu huyết tương sẽ được thêm acetonitrile hoặc methanol sau đó được lắc và ly tâm để loại bỏ protein kết tủa xuống dưới đáy của lọ đựng. Một lưu ý khác là khi phân tích các dạng metabolite liên hợp trong mẫu nước tiểu, β-glucuronidase có thể được thêm vào để thuỷ phân các dạng liên hợp ezetimibe-glucuronide thành ezetimibe trước khi phân tích.

Việc lựa chọn phương pháp chiết phụ thuộc vào các yếu tố như tính chất hóa học của thuốc, nền mẫu và độ nhạy mong muốn. Bảng 1 tóm tắt một số phương pháp xử lý mẫu được và đối tượng mẫu được báo cáo trong một số nghiên cứu đã công bố.

Bảng 1. Một số kỹ thuật xử lý mẫu được sử dụng để phân tích các thuốc hạ cholesterol trong các đối tượng mẫu sinh học.

Thuốc	Loại mẫu	Kỹ thuật chiết	Dung môi/cột chiết	Chất nội chuẩn	Nguồn
Atorvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	LLE	Dietyl ete-diclorometan (70:30, v/v)	Atorvastatin	[doi:10.5740/jaoacint.11-117]
Atorvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	LLE	Etyl axetat	Pitavastatin	[doi:10.1093/chromsci/52.8.773]
Rosuvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	LLE	Metyl tert-butyl ete (MTBE)	Rosuvastatin-d6	[doi: 10.1002/jssc.201800246]
Ezetimibe	Huyết tương người	LLE	Metyl tert-butyl ete	13C6-Ezetimibe	[doi:10.1016/j.jpba.2005.07.029]
Ezetimibe, Ezetimibe-G	Huyết tương người	SPE	Cột SPE Oasis HLB, đệm amoni axetat-axit axetic (0,2 M, pH 6,0)	Ezetimibe-d4	[doi:10.1016/j.jchromb.2015.02.012]
Amlodipine, Atorvastatin	Huyết tương người	LLE	Etyl axetat	Không xác định	[doi: 10.1080/2331205X.2015.1129790]
Atorvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	LLE	tert-Butyl metyl ete	Ezetimibe-d4	[doi:10.1016/j.scia.2013.01.004]
Simvastatin, Simvastatin-axit	Huyết tương người	LLE	Etyl axetat với đệm amoni format	Fluvastatin	[doi:10.1016/j.talanta.2023.100258]
Ezetimibe	Mẫu tình nguyện	LLE	tert-Butyl metyl ete	-	[doi:10.1016/j.scia.2013.01.004]
13 Thuốc hạ lipid máu	Dấu vân tay	Kết tủa protein	Methanol (0,5 mL)	-	[doi:10.1016/j.jchromb.2021.122496]

Các quy trình chuẩn bị mẫu để phân tích các thuốc hạ cholesterol trong mẫu sinh học, điển hình là huyết tương, có một số đặc điểm chung. Phần lớn các nghiên cứu sử dụng LLE, trong đó một dung môi hữu cơ được thêm vào mẫu, hỗn hợp được lắc và ly tâm, dẫn đến sự phân bố của chất phân tích vào pha hữu cơ. Thêm vào đó chiết pha rắn (SPE) cũng là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến, đặc biệt trong phân tích đồng thời ezetimibe và chất chuyển hóa glucuronide của ezemtibe, mẫu được cho đi qua một cột chiết chứa vật liệu có khả năng giữ chọn lọc chất phân tích. Chất phân tích sau đó được rửa giải khỏi cột bằng một dung môi thích hợp. Việc thêm vào mẫu huyết tương chất nội chuẩn (một hợp chất có cấu trúc tương đồng với chất phân tích nhưng có thể phân biệt được trong quá trình phân tích) trước hoặc sau quá trình xử lý mẫu cũng rất phổ biến tuỳ thuộc vào mục đích của phân tích. Việc thêm nội chuẩn nhằm mục đích hiệu chỉnh các sai số phát sinh trong quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích, từ đó đảm bảo độ chính xác của kết quả. Tùy thuộc vào kỹ thuật chiết được lựa chọn, các bước xử lý mẫu có sự khác biệt (Bảng 2). Cuối cùng, pha hữu cơ thu được từ quá trình LLE hoặc dịch rửa giải từ SPE hoặc quy trình kết tủa protein được làm bay hơi đến khô, phần cặn khô sau đó được tái hòa tan trong một thể tích nhỏ dung môi thích hợp cho phân tích.

Bảng 2. Chi tiết các bước xử lý mẫu được sử dụng trong một số quy trình tham khảo

Thuốc	Loại mẫu	Các bước chuẩn bị mẫu	Nguồn
Atorvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	1. Thêm 25 µL dung dịch làm việc của chất chuẩn nội (IS) vào 250 µL mẫu huyết tương. 2. Trộn bằng máy lắc vortex trong 30 giây. 3. Thêm 3 mL hỗn hợp chiết (dietyl ete-diclorometan, 70:30, v/v). 4. Lắc vortex trong khoảng 2 phút và ly tâm ở 3000 × g trong 5 phút. 5. Chuyển lớp hữu cơ sang ống thủy tinh sạch và làm bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng. 6. Hòa tan lại cặn trong 200 µL pha động.	[doi:10.5740/jaoacint.11-117]
Atorvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	1. Thêm 6 mL etyl axetat vào 1000 mL các chuẩn huyết tương hoặc mẫu QC đã thêm chất chuẩn. 2. Lắc vortex trong 1 phút và ly tâm ở 5000 vòng/phút ở 4°C trong 5 phút. 3. Thu khoảng 4,0 mL dịch nổi và làm bay hơi đến khô dưới nitơ ở 40 ± 5°C. 4. Hòa tan lại cặn trong 500 µL pha động và chuyển sang lọ lấy mẫu tự động.	[doi:10.1093/chromsci/52.8.773]
Rosuvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	1. Rã đông các mẫu huyết tương người đông lạnh và cân bằng về nhiệt độ phòng. 2. Thêm 50 µL dung dịch kết hợp các chuẩn nội (IS) và 200 µL dung dịch đệm amoni format 0,1M (pH 3.5) vào 300 µL huyết tương hoặc mẫu đã thêm chuẩn. 3. Lắc vortex để trộn. 4. Chiết các chất phân tích và IS bằng 2,5 mL MTBE trên máy lắc xoay trong 10 phút ở 32 × g. 5. Ly tâm các mẫu ở 3200 × g trong 5 phút ở 10 °C. 6. Tách lớp hữu cơ và làm bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ nhẹ trong bể điều nhiệt duy trì ở 40 °C. 7. Hòa tan lại các mẫu đã làm khô bằng 200 µL dung dịch pha động, lắc vortex nhanh và tiêm 10 µL vào hệ thống sắc ký.	[doi: 10.1002/jssc.201800246]
Ezetimibe	Huyết tương người	1. Rã đông các mẫu huyết tương người đông lạnh ở nhiệt độ môi trường. 2a. Đối với phân tích ezetimibe tự do: - Chuyển 200 µL mẫu huyết tương vào ống nghiệm polypropylen 2 mL, thêm 10 µL dung dịch chất chuẩn nội (10 ng/mL), lắc vortex nhanh, sau đó chiết bằng 1 mL metyl tert-butyl ete. 2b. Đối với phân tích tổng ezetimibe: - Chuyển 100 µL mẫu huyết tương và 10 µL dung dịch chất chuẩn nội (250 ng/mL) vào ống nghiệm polypropylen 5 mL, sau đó thêm 250 µL dung dịch đệm natri axetat (0,5 M, pH 5,0) và 50 µL β-glucuronidase (100.000 IU/mL). Lắc vortex trong 30 giây và ủ ở 50 °C trong 60 phút. Thêm 250 µL dung dịch natri borat (0,1 M). Chiết hỗn hợp bằng 2 mL metyl tert-butyl ete trong 10 phút bằng cách lắc vortex và sau đó ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. 3. Sau khi ly tâm, dịch nổi được chuyển sang ống polypropylen sạch và làm khô bằng dòng khí nitơ ở 40 °C. 4. Cặn được hòa tan lại bằng 100 µL methanol và 5 µL được tiêm vào hệ thống LC–MS/MS.	[doi:10.1016/j.jpba.2005.07.029]
Ezetimibe, Ezetimibe-G	Huyết tương người	1. Trộn 200 μL huyết tương đã thêm chất chuẩn với 10 μL dung dịch làm việc của chất chuẩn nội (50 ng/mL) với 300 μL dung dịch đệm amoni axetat-axit axetic (0,2 M, pH 6,0) và lắc vortex trong 1 phút. 2. Cân bằng cột SPE (Oasis HLB) bằng 1 mL methanol, 1 mL nước tinh khiết và 1 mL dung dịch đệm amoni axetat-axit axetic (pH 6,0). 3. Nạp mẫu huyết tương lên hộp SPE. 4. Rửa cột bằng 1 mL methanol 5% (với 2% amoniac) và 1 mL nước tinh khiết. 5. Rửa giải bằng 1 mL methanol. 6. Làm bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới không khí ở 60 °C. 7. Hòa tan lại cặn trong 200 µL pha động và tiêm 20 µL vào hệ thống LC–MS/MS.	[doi:10.1016/j.jchromb.2015.02.012]
Amlodipine, Atorvastatin	Huyết tương người	1. Hút 200 µL mẫu huyết tương đã thu vào ống ly tâm 10 mL. 2. Thêm 2,5 mL etyl axetat và lắc vortex trong 3 phút. 3. Ly tâm ở 15.400 × g trong 10 phút. 4. Chuyển lớp hữu cơ sang ống ly tâm 10 mL khác và làm bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ nhẹ trong bể nước ở 40 °C. 5. Hòa tan lại cặn trong 200 µL pha động và tiêm 10 µL vào hệ thống LC–MS.	[doi: 10.1080/2331205X.2015.1129790]
Atorvastatin, Ezetimibe	Huyết tương người	1. Thêm 200 µL dung dịch chuẩn nội (100 ng/mL Ezetimibe-d4 trong methanol) vào 500 µL mẫu huyết tương. 2. Thêm 100 µL dung dịch đệm phosphat (0,025 mol/L, pH 6,8) và lắc vortex trong 1 phút. 3. Thêm 5 mL tert-butyl metyl ete. Lắc vortex trong 2 phút và ly tâm ở 3000 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. 4. Chuyển 4,5 mL lớp hữu cơ trên cùng vào ống đã dán nhãn và làm bay hơi đến khô dưới chân không ở 45 °C. 5. Hòa tan lại cặn bằng 100 µL pha động (axit formic 0,1% trong nước và acetonitrile, 95:5), lắc vortex trong 30 giây và tiêm 10 µL vào cột.	[doi:10.1016/j.scia.2013.01.004]
Simvastatin, Simvastatin-axit	Huyết tương người	1. Thêm 50 μL IS (fluvastatin) vào 100 μL mẫu huyết tương. 2. Thêm 173 μL dung dịch đệm amoni axetat 10 mM (pH 5.0) và lắc vortex trong 10 giây. 3. Thêm 2200 μL etyl axetat, lắc vortex trong 1 phút và ly tâm trong 15 phút ở 1850 ×g. 4. Chuyển dịch nổi sang ống khác và làm bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ ở 45 °C. 5. Hòa tan lại cặn đã làm khô bằng 100 μL methanol/nước (50:50, v/v) và lắc vortex trong 10 giây. Tiêm 10 μL dung dịch này vào hệ thống LC-MS/MS.	[doi:10.1016/j.talanta.2023.100258]
Ezetimibe	Mẫu tình nguyện	1. Thêm chất chuẩn nội (IS, 100 ng/mL trong methanol) vào 500 µL mẫu tình nguyện. 2. Thêm 100 µL dung dịch đệm phosphat (pH 6.8). Sau khi trộn bằng vortex trong 1 phút, thêm 5 mL tert-butyl metyl ete. 3. Trộn vortex trong 2 phút và ly tâm ở 3000 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. 4. Chuyển 4,5 mL lớp hữu cơ trên cùng sang ống khác và làm bay hơi đến khô dưới chân không ở khoảng 45 °C. 5. Hòa tan lại cặn bằng 100 µL pha động, trộn bằng vortex trong 30 giây và tiêm 10 µL dung dịch này vào cột.	[doi:10.1016/j.scia.2013.01.004]
13 Thuốc hạ lipid máu	Dấu vân tay	1. Ấn ngón trỏ vào giấy lọc 3 × 3 cm với lực vừa phải trong 30 giây sau khi đeo găng tay dùng một lần trong 2 phút. 2. Thêm 25 µL dung dịch hiệu chuẩn vào dấu vân tay trắng để chuẩn bị các mẫu đã thêm chất chuẩn. 3. Cắt giấy lọc có dấu vân tay thành từng miếng và đặt vào ống ly tâm nhựa 2 mL. 4. Hòa tan chất lắng dấu vân tay trong 0,5 mL methanol, lắc vortex trong 1 phút, siêu âm trong 3 phút và ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 5 phút. 5. Phân tích dịch nổi.	[doi:10.1016/j.jchromb.2021.122496]

3. Phân tích các thuốc hạ cholesteron với khối phổ

Mẫu sau khi đã tái hòa tan được bơm vào hệ thống phân tích, thường là LC-MS/MS. Kỹ thuật này cho phép tách chất phân tích và chất chuẩn nội dựa trên các đặc tính hóa học của chúng và xác định hàm lượng tương ứng. LC-MS/MS đã được ứng dụng thành công trong nhiều nghiên cứu dược động học để định lượng nồng độ thuốc tự do và tổng trong huyết tương người sau khi dùng thuốc. Ví dụ, các nghiên cứu đã định lượng atorvastatin và chất chuyển hóa 2-hydroxyatorvastatin trong huyết tương người. Ngoài ra, LC-MS/MS đã được sử dụng để đo ezetimibe và chất chuyển hóa glucuronide của nó trong huyết tương sau khi chuẩn bị mẫu SPE. Các ứng dụng này làm nổi bật tính linh hoạt của LC-MS/MS trong việc nghiên cứu sự hấp thụ, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của các thuốc hạ cholesterol.

Hình 2. Phổ MS đại diện của ezetimibe (A), Atorvastatin calcium salt trihydrate (B) và simvastatin (C) (Nguồn: 10.1556/1326.2020.00752).

Hình 3. Phổ TIC LC-MS của cả 3 chất phân tích và 1 chất nội chuẩn (A) và phổ EIC của ezetimibe (A), Atorvastatin calcium salt trihydrate (B) và simvastatin (C) (Nguồn: 10.1556/1326.2020.00752)

Nhiều phương pháp LC-MS khác nhau đã được phát triển để phân tích các thuốc hạ cholesterol, trong đó các cột C18 pha đảo (VD: Acquity UPLC® BEH C18, Eclipse-plus C18, Symmetry C18…) được sử dụng phổ biến. Pha động thường bao gồm các dung môi nước và hữu cơ, kèm các chất phụ gia như: axit formic, amoni acetate… để cải thiện hình dạng của píc, tăng cường phân giải píc, cải thiện thời gian lưu và hiệu suất ion hóa. Các kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng bao gồm ion hóa phun sương điện tử (ESI) và ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI). Việc lựa chọn kỹ thuật ion hóa phụ thuộc vào các đặc tính của chất phân tích và độ nhạy mong muốn. Việc phát hiện thường được thực hiện bằng cách sử dụng các chế độ giám sát phản ứng chọn lọc (SRM) hoặc giám sát nhiều phản ứng (MRM) để tăng độ nhạy và độ chọn lọc. Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được báo cáo cho các thuốc hạ cholesterol khác nhau tùy thuộc vào phương pháp phân tích cụ thể, cách chuẩn bị mẫu và thiết bị được sử dụng (Bảng 3). Ví dụ, LOD cho ezetimibe dao động từ 0,02 ng/mL đối với ezetimibe tự do đến 0,60 µg/mL khi sử dụng điện di mao quản (CZE). Tương tự, LOD cho atorvastatin dao động từ 0,003 ng/miếng dán khi sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao kết hợp với khối phổ Q-TRAP đến 0,42 µg/mL với CZE.

Bảng 3. Giá trị LOD, LOQ cho 1 số thuốc hạ cholesteron đã được báo cáo

Thuốc	LOD (ng/mL)	LOQ (ng/mL)	Nguồn DOI	Phương pháp phân tích
Ezetimibe	0,25	1,25	10.1556/JPC.25.202.399	LC-MS/MS
Atorvastatin	0,25	0,75	10.1556/JPC.25.202.399	LC-MS/MS
Simvastatin	0,75	2.5	10.1556/JPC.25.202.399	LC-MS/MS
Ezetimibe	0,48	1,46	10.1556/JPC.25.202.399	LC-MS/MS
Atorvastatin	0,54	1,64	10.1556/JPC.25.202.399	LC-MS/MS
Simvastatin	0,27	0,82	10.1556/JPC.25.202.399	LC-MS/MS
Amlodipine	0,05	0,1	10.1080/2331205X.2015.1129790	LC-MS
Atorvastatin	0,1	0,2	10.1080/2331205X.2015.1129790	LC-MS
Rosuvastatin	-	0,1	10.5530/jyp.2017.9.22_0	CZE
Ezetimibe	-	1,84	10.5530/jyp.2017.9.22_0	CZE
Atorvastatin	-	1,23	10.5530/jyp.2017.9.22_0	CZE
Ezetimibe	-	0,6	10.5530/jyp.2017.9.22_0	CZE

4. Kết luận

Mặc dù có nhiều ưu điểm trong việc sử dụng LC-MS để phân tích các thuốc hạ cholesterol trong mẫu sinh học, tuy nhiên vẫn tồn tại những thách thức trong việc phân tích các hợp chất này. Một thách thức là khả năng chuyển đổi tại nguồn các dạng lactone của statin (ví dụ: simvastatin) thành các dạng axit hydroxy hoạt động dẫn đến việc định lượng không chính xác. Một thách thức khác là sự hiện diện của các đồng phân, đối quang, hoặc đồng phân lập thể cho một số loại thuốc, đòi hỏi các phương pháp có khả năng tách và định lượng các đồng phân riêng lẻ.

Việc tiếp tục phát triển và tối ưu hóa các phương pháp LC-MS là rất cần thiết để giải quyết những thách thức này và tiếp tục cải thiện việc phân tích các loại thuốc hạ cholesterol. Các định hướng trong tương lai bao gồm việc khám phá các kỹ thuật chuẩn bị mẫu mới để giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu và cải thiện độ thu hồi, phát triển các phương pháp LC-MS nhạy và chọn lọc hơn để định lượng các chất chuyển hóa có hàm lượng thấp, và ứng dụng các phương pháp LC-MS để nghiên cứu các tác động chuyển hóa rộng hơn của thuốc hạ cholesterol.

5. Tài liệu tham khảo

Abdelbary, G., & El-Gendy, A. (2013). A validated liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of atorvastatin and ezetimibe in human plasma: Application to a bioequivalence study. Journal of Pharmaceutical Research, 10(2), 171-178.

Bhadoriya, D. (2018). Simultaneous estimation of rosuvastatin and ezetimibe in human plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study. Journal of Pharmaceutical Analysis, 8(5), 316–321. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2018.03.002

Danafar, H., & Hamidi, M. (2013). A rapid and sensitive LC–MS method for determination of ezetimibe concentration in human plasma: Application to a bioequivalence study. Chromatographia, 76, 1667–1675. https://doi.org/10.1007/s10337-013-2548-x

Du, Q., Zhang, Y., Wang, J., & Liu, B. (2021). Simultaneous determination and quantitation of hypolipidemic drugs in fingerprints by UPLC-Q-TRAP/MS. Journal of Chromatography B, 1175, 122496. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2020.122496

Guo, L., Wang, M., He, M., Qiu, F., & Jiang, J. (2015). Simultaneous determination of ezetimibe and its glucuronide metabolite in human plasma by solid phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 986-987, 87–93. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.02.012

Kurbanoglu, S., Esim, O., Ozkan, C. K., Savaser, A., Ozkan, Y., & Ozkan, S. A. (2019). Stability indicating RP-HPLC method for the simultaneous determination of ezetimibe and atorvastatin in their combined dosage form: Method development and validation. Chromatographia, 82(2), 279–285. https://doi.org/10.1007/s10337-018-8440-6

Li, S., Liu, G., Jia, J., Li, X., & Yu, C. (2006). Liquid chromatography–negative ion electrospray tandem mass spectrometry method for the quantification of ezetimibe in human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40(4), 987–992. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2005.07.053

Oswal, S., Scheuch, E., Cascorbi, I., & Siegmund, W. (2006). A LC–MS/MS method to quantify the novel cholesterol-lowering drug ezetimibe in human serum, urine and feces in healthy subjects genotyped for SLCO1B1. Journal of Chromatography B, 830(2), 143–150. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2005.10.045

Park, J., Kang, W., Seong, S., Gwon, M., Kim, B., Na, S., Kim, H., Yoon, Y., Lee, H., & Shin, D. (2017). Pharmacokinetic and pharmacodynamic interaction of atorvastatin and ezetimibe in healthy subjects. Translational and Clinical Pharmacology, 25(2), 202–208. https://doi.org/10.1556/JPC.25.202.399

Patel, D., Patel, N., & Desai, P. (2017). A rapid and sensitive stability-indicating reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of related substances of ezetimibe and simvastatin in combined dosage forms. Chromatographia, 80(3), 85–94. https://doi.org/10.1007/s10337-017-3284-x

Varghese, S. J., & Ravi, T. K. (2013). Development and validation of a liquid chromatography/mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of rosuvastatin and ezetimibe in human plasma. Journal of AOAC International, 96(2), 307–312. https://doi.org/10.5740/jaoacint.12-261

Wang, L., Chai, Y., Sun, C., Zhu, W., Pan, Y., & Zeng, S. (2017). Direct Differentiation of Stereoisomers of Ezetimibe:Ambrisentan:Atorvastatin and their Mechanism Study by Electrospray Ionization Quadurupole Time-of-Flight Mass. Scientific Reports, 7(1), 1–9. https://doi.org/10.1038/s41598-017-09471-z

Yadav, S., Suresh, K., & Bhadoriya, D. (2015). Method validation of amlodipine and atorvastatin by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) method in human plasma. Arabian Journal of Chemistry, 13(1), 184–193. https://doi.org/10.1080/2331205X.2015.1129790