Ứng dụng phương pháp chiết pha rắn 96 giếng thể tích rửa giải cực thấp mới để xác định simvastatin và axit simvastatin bằng LC/MS/MS trong huyết tương người

Giới thiệu: Bài viết này tóm tắt và lược dịch nội dung trong nghiên cứu “Application of a novel ultra-low elution volume 96-well solid-phase extraction method to the LC/MS/MS determination of simvastatin and simvastatin acid in human plasma, Amy Y. Yang, Li Sun, Donald G. Musson, Jamie J. Zhao, DOI: 10.1016/j.jpba.2005.01.016”. Thêm vào đó cung cấp cho bạn đọc một số thông tin cơ bản liên quan tới việc phân tích một số thuốc có tác dụng giảm chloesterol trong mẫu sinh học. Về người dịch, TS. Lê Sĩ Hưng, tốt nghiệp tiến sĩ tại đại học BOKU Vienna (Cộng hoà Áo) ngành hoá phân tích, đã có trên 10 năm kinh nghiệm làm việc với các thiết bị khối phổ, tập trung vào ứng dụng các kỹ thuật khối phổ trong phân tích các chất chuyển hoá và protein trong các đối tượng mẫu sinh học, ORCID: 0000-0002-0762-3492



Tóm tắt

Phương pháp chiết mới được sử dụng trong việc xác định simvastatin và axit simvastatin bằng LC/MS/MS trong huyết tương người. Theo phương pháp này, 300 µL mẫu huyết tương được nạp vào đĩa μElution HLB 96 giếng của Waters Oasis, pha tĩnh được rửa bằng 2 × 400 µL MeOH 5% trong nước và các chất phân tích được rửa giải bằng 35 µL ACN/H₂O:95/5 hai lần. Các mẫu chiết được pha loãng trong 40 µL amoni metyl acetat (1 mM, pH 4,5). Tách sắc ký được thực hiện trên cột Phenomenex Synergi Max-RP (2,0 mm × 50 mm, 4 µm). Thiết bị Sciex API 3000 giao diện với nguồn turbo ionspray được sử dụng để phân tích các chất. So với các phương pháp chiết pha rắn, chiết lỏng-lỏng và các phương pháp chiết lỏng-lỏng trên chất rắn hỗ trợ đã được phát triển và sử dụng trước đây trong phòng thí nghiệm, phương pháp mới này giảm chi phí nhân công và ít tốn thời gian hơn trong quá trình chuẩn bị mẫu, nhờ loại bỏ bước bay hơi dung môi và hoàn nguyên mẫu sau chiết đã được loại bỏ bằng cách sử dụng đĩa chiết pha rắn μElution này. Phương pháp này đã được chứng minh là nhanh, đáng tin cậy và có thể tái tạo.

Từ khóa: Simvastatin; Axit simvastatin; SPE; đĩa μElution; LC/MS/MS; Huyết tương người

1. Giới thiệu

Simvastatin là một tác nhân có hiệu quả cao để điều trị chứng tăng cholesterol máu [1]. Sau khi uống, simvastatin (SV), một lacton không hoạt động, được thủy phân in vivo nhanh chóng thành axit β-hydroxy tương ứng của nó, axit simvastatin (SVA) (Hình 1). Chất sau là một chất ức chế mạnh của HMG-CoA reductase. Các phương pháp LC/MS/MS để định lượng SV và SVA trong huyết tương người đã được báo cáo trước đây bằng cách sử dụng các quy trình chiết khác nhau [2–5], bao gồm chiết pha rắn [2], chiết lỏng-lỏng [3] và chiết lỏng-lỏng trên chất rắn hỗ trợ [4] được sử dụng trong phòng thí nghiệm của chúng tôi và chiết trực tiếp [5] bởi Jemel et al. Phương pháp chiết SPE trực tiếp (online SPE) cho phép làm sạch mẫu đơn giản và tiết kiệm nhân công, tuy nhiên, giới hạn định lượng thấp LLOQ tương đối cao là 0,5 ng.mL^-1 và sự chuyển hóa qua lại cao hơn giữa SV và SVA (≤1,0%) không đáp ứng yêu cầu phân tích. Trong số các phương pháp chiết offline, chiết lỏng-lỏng trên chất rắn hỗ trợ trên các cột SPE Chem Elut đã được sử dụng rộng rãi, do độ nhạy tốt (LLOQ là 0,05 ng mL^-1), độ tái lặp và hiệu suất chiết cao với hiệu suất chuyển hoá qua lại giữa SV và SVA không đáng kể. Tuy nhiên, phiên bản tự động của chiết lỏng-lỏng trên chất rắn hỗ trợ [6,7] tương đối phức tạp và bước bay hơi dung môi rất tốn thời gian do phải sử dụng 1 lượng lớn dung môi rửa giải trong khi thể tích của các đĩa giếng 96 lại nhỏ và cần phải sử dụng nhiều bước rửa giải và bay hơi. Trong nghiên cứu này, phương pháp phân tích mới sử dụng SPE μElution Oasis HLB để định lượng SV và SVA bằng LC/MS/MS trong huyết tương người được phát triển và thẩm định, phương pháp này không yêu cầu bay hơi dung môi và tái tạo và giảm đáng kể thời gian chuẩn bị mẫu và cải thiện hiệu quả xét nghiệm.

Hình 1. Cấu trúc của các chất phân tích và các chất nội chuẩn.

2. Phương pháp

2.1. Vật liệu, hóa chất và thuốc thử

Các chất chuẩn SV và SVA được tổng hợp bởi Phòng Nghiên cứu Merck. Nội chuẩn đồng vị bền ¹³CD₃-SV và ¹³CD₃-SVA, được tổng hợp bởi Phòng Nghiên cứu Dược phẩm và Trao đổi chất của Merc. Độ tinh khiết đồng vị cho cả hai chất nội chuẩn đều >98,5%.

Các đĩa rửa giải được đóng nhồi chất hấp phụ SPE Oasis HLB. Amoni acetat (cấp HPLC), methylamine (dung dịch 40% trong nước), ACN và MeOH được mua từ Fisher Scientific (Fairlawn, NJ, Hoa Kỳ). Mẫu huyết tương đối chứng gộp của người (đã heparin hóa) được mua từ Biological Specialty (Lansdale, PA, Hoa Kỳ). Nước khử ion được chuẩn bị bằng hệ thống nước Milli-Q Plus Ultra-Pure (Millipore, Bedford, MA, Hoa Kỳ).

2.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn và QC

• Mẫu chuẩn và mẫu QC: Các dung dịch gốc của simvastatin (SV), axit simvastatin (SVA) và các chất nội chuẩn được pha trong acetonitrile hoặc hỗn hợp acetonitrile/nước. Các mẫu chuẩn có nồng độ từ 0,05 đến 50 ng/mL, và các mẫu QC được chuẩn bị ở 3 nồng độ (0,1, 20, 40 ng/mL) trong huyết tương người.
• Thêm chất nội chuẩn vào mỗi mẫu huyết tương (300 µL), 30 µL chất nội chuẩn (13CD3-SV và 13CD3-SVA) ở nồng độ 50 ng/mL được thêm vào.
• Xử lý mẫu: Thêm 100 µL dung dịch đệm amoni acetat 100 mM (pH 4.5) vào mẫu, lắc đều.

2.3. Chiết mẫu huyết tương

• Chuẩn bị đĩa SPE: Đĩa 96 giếng Waters Oasis HLB μElution được hoạt hóa bằng 200 µL MeOH, sau đó là 200 µL nước.
• Nạp mẫu: Mẫu huyết tương đã xử lý được nạp vào đĩa SPE.
• Rửa cột: Đĩa được rửa hai lần bằng 400 µL dung dịch MeOH 5% trong nước.
• Rửa giải chất phân tích: Chất phân tích được rửa giải hai lần bằng 35 µL dung dịch ACN/H₂O 95/5 (v/v) vào đĩa 96 giếng mới.
• Pha loãng: Dung dịch thu được sau khi rửa giải được pha loãng bằng 40 µL dung dịch đệm methyl amoni acetat 1 mM (pH 4,5).

2.4. LC-MS/MS

• Sắc ký lỏng (LC): Mẫu được phân tách trên cột Phenomenex Synergi Max-RP (50 mm x 2.0 mm, 4 µm), pha động là hỗn hợp acetonitrile/đệm methyl amoni acetat 1mM (80/20, v/v). Tốc độ dòng 200 µL/phút.
• Khối phổ (MS/MS): Chất phân tích được phát hiện bằng thiết bị khối phổ ba tứ cực Sciex API 3000 với chế độ ion hoá âm cho SVA và chế độ ion hoá dương cho SV. Nhiệt độ nguồn: 350^oC. Các cặp ion giám sát (m/z) như sau: SVA (435.2 → 319.1), ¹³CD₃-SVA (439.2 → 319.1), SV (450.3 → 285.1), ¹³CD₃-SV (454.3 → 285.1). Thiết bị được vận hành ở chế độ ion âm trong khoảng 2 phút đầu với thời gian dừng 500 ms, sau đó ở chế độ ion dương trong phần còn lại của quá trình phân tích với thời gian dừng 500 ms. Dung dịch đệm amoni metyl acetat được sử dụng trong pha động để cải thiện hiệu quả ion hóa và độ nhạy cho SV [10].

Hình 2. (a) Phổ XIC của mẫu trắng kép trong nền huyết tương người. (b) Phổ XIC của mẫu huyết tương trước khi dùng thuốc của người. (c) XIC của mẫu huyết tương người 2 giờ sau khi dùng 80 mg SV (nồng độ SV và SVA lần lượt là 0,993 và 4,785 ng.mL^-1)

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Tối ưu hóa các điều kiện chuẩn bị mẫu

• Ảnh hưởng pH: pH 4.5 của dung dịch đệm amoni acetat là tối ưu để giảm thiểu sự chuyển hóa giữa SV và SVA trong quá trình chiết và phân tích. Sự chuyển đổi lẫn nhau giữa SV và SVA là không đáng kể (<0,08%).
• Dung dịch rửa: Dung dịch methanol 5% trong nước được xác định là phù hợp để rửa bỏ các chất nền mà không làm mất chất phân tích.
• Dung dịch rửa giải: Dung dịch acetonitrile/nước 95/5 cho thấy độ thu hồi tốt nhất cho cả SV và SVA.

Hình 3: Ảnh hưởng của pH đệm đến sự chuyển đổi lẫn nhau giữa SV và SVA.

3.2. Thẩm định phương pháp

• Độ chụm và độ chính xác trong ngày (intra-assay): Độ chụm (CV) từ 1,2 - 7%, độ chính xác từ 94,4 - 105,7% cho cả SV và SVA ở các nồng độ khác nhau.
• Độ chụm và độ chính xác giữa các ngày (inter-assay): Độ chụm (RSD) từ 0,4 - 4.8%, độ chính xác từ 91,2 – 99,0% cho cả SV và SVA.
• Độ thu hồi: Độ thu hồi của phương pháp là 66% cho SV và 73% cho SVA.
• Độ đặc hiệu: Không có nhiễu xuất hiện ở thời gian lưu của SV và SVA
• Ảnh hưởng nền mẫu: Có hiệu ứng ức chế ion ~ 16% cho SV.
• Giới hạn định lượng (LLOQ): 0,05 ng/mL cho cả SV và SVA.
• Độ ổn định: SV và SVA ổn định trong 24 giờ khi được bảo quản trong autosampler.

Bảng 1. Độ chính xác và độ chụm trong ngày của SV và SVA trong huyết tương người

Bảng 2. Độ chính xác và độ chụm QC giữa các ngày của SV và SVA trong huyết tương người

4. Tài liệu tham khảo

[1] W.F. Hoffman, A.W. Alberts, P.S. Anderson, R.L. Smith, A.K. Willard, J. Med. Chem. 29 (1998) 849–852.

[2] J.J. Zhao, J.D. Rogers, Proceedings of the 45th ASMS Conferences on Mass Spectrometry and Allied Topics, Palm Springs, CA, June 1–5, 1997, pp. 717.

[3] J.J. Zhao, J.D. Rogers, Proceedings of the 47th ASMS Conferences on Mass Spectrometry and Allied Topics, Dallas, TX, June 13–17, 1999, #TPF199.

[4] J.J. Zhao, I.H. Xie, A.Y. Yang, B.R. Roadcap, J.D. Rogers, J. Mass Spectrom. 35 (2000) 1133–1143.

[5] M. Jemel, Z. Ouyang, M.L. Powell, J. Pharm. Biomed. Anal. 23 (2000) 323–340.

[6] B.A. Roadcap, J.D. Rogers, J.J. Zhao, Proceedings of the 50th ASMS Conferences on Mass Spectrometry and Allied Topics, Orlando, FL, June 2–6, 2002, #MPF187.

[7] L. Liu, R. Valesky, D.G. Musson, J.J. Zhao, Proceedings of the 51th ASMS Conferences on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Que., Canada, June 8–12, 2003, #MPE3 101.

[8] C.R. Mallet, Z. Lu, R. Fish, J.R. Mazzeo, U.D. Neue, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17 (2003) 163–170.

[9] N. Zhang, A.Y. Yang, J.D. Rogers, J.J. Zhao, J. Pharm. Biomed. Anal. 34 (2004) 175–187.

[10] J.J. Zhao, A.Y. Yang, J.D. Rogers, J. Mass Spectrom. 37 (2002) 421–433.

[11] R. Fisk, J. Belanger, P. Iraneta, S. Serpa, Z. Lu, C.R. Mallet, J.R. Mazzeo, U.D. Neue, Y. Cheng, LC/GC, The Application Notebook, June 2003, pp. 22–23.