Trong kính hiển vi quang học, chất lượng mẫu không phải lúc nào cũng dễ dàng quan sát và cho độ tương phản tốt nếu chỉ dùng trường sáng thông thường. Vì một số mẫu dường như không hấp thụ ánh sáng nên khó có thể phân biệt mẫu và môi trường, cũng như các chi tiết của mẫu. Các nghiên cứu với mẫu có độ tương phản thấp như vi khuẩn không nhuộm, mẫu mô mỏng, tế bào sống cần các kỹ thuật tăng cường tương phản chuyên biệt để hỗ trợ về hình ảnh các mẫu hầu như trong suốt này. 

Các phương pháp làm tăng độ tương phản cho mẫu bao gồm kỹ thuật trường tối, phản pha, phân cực, DIC và Hoffman. Một số kỹ thuật bị giới hạn bởi các mẫu dày như mô thực vật, động vật,… ngoài ra kỹ thuật phân cực đòi hỏi mẫu vật phải có tính lưỡng chiết.

Kỹ thuật trường sáng

Một trong những kỹ thuật chính được sử dụng trong tất cả các dạng kính hiển vi quang học trong ba thế kỷ qua, sự chiếu sáng của trường sáng dựa trên những thay đổi về hấp thụ ánh sáng, chỉ số khúc xạ hoặc màu sắc để tạo ra độ tương phản. Khi ánh sáng truyền qua mẫu vật, các vùng thay đổi hướng, tốc độ hoặc phổ của các mặt sóng tạo ra sự khác biệt quang học (độ tương phản) khi các tia được thu thập và tập trung bởi vật kính. Độ phân giải trong hệ thống trường sáng phụ thuộc vào cả khẩu độ số của vật kính và tụ quang. Kỹ thuật này hữu ích với các mẫu có màu hoặc được nhuộm màu. 

Hình ảnh: Mẫu mô nhuộm quan sát trong trường sáng

Kỹ thuật trường tối

Kính hiển vi trường tối được sử dụng rộng rãi cho các mẫu vật trong suốt trong suốt thế kỷ 19 và 20. 

Kính hiển vi trường tối là một kỹ thuật chiếu sáng chuyên dụng giúp tận dụng ánh sáng xiên để tăng độ tương phản trong các mẫu vật không được chụp ảnh tốt trong điều kiện chiếu sáng thông thường. Một nền tối nhân tạo được tạo ra trong kính hiển vi bằng cách sử dụng một điểm dừng hình khuyên trong tụ quang. Trong kính hiển vi trường tối , vật kính nằm trong phần rỗng tối của hình nón này và ánh sáng sẽ đi xung quanh vật kính, nhưng không đi vào khu vực hình nón. Mặc dù ánh sáng tụ quang sau đó chiếu sáng mẫu, chúng đi qua với một hình nón rỗng, ánh sáng đi qua mẫu ở góc xiên sao cho chỉ có ánh sáng tương tác với các đặc tính mẫu mới có thể đi vào kính hiển vi. Hình ảnh sáng của mẫu hiện lên trên nền tối. Kính hiển vi trường tối là một công cụ tuyệt vời để điều tra sinh học và y tế.

Kỹ thuật phản pha

Được mô tả đâù tiên bởi Frits Zernike vào năm 1934 – nhà vật lý và toán học người Hà Lan, kỹ thuật tương phản đã giúp ông đoạt giải Nobel vật lý năm 1953 trong cuộc cách mạng hóa nghiên cứu y sinh cơ bản về tế bào sống. Kỹ thuật này là lý tưởng cho các mẫu vật mỏng chưa nhuộm (chẳng hạn như các tế bào nuôi cấy trên thủy tinh). Những mẫu vật này hầu như không thể hiện bất kỳ sự hấp thụ ánh sáng nào trong phần nhìn thấy được của quang phổ và mắt người không thể phát hiện chúng trong vùng sáng và vùng tối.

Kính hiển vi phản pha là một kỹ thuật giúp chuyển đổi pha của ánh sáng xuyên qua mẫu để tạo ra sự thay đổi trong ánh sáng của hình ảnh. Khi sóng ánh sáng truyền qua môi trường không phải chân không, sự tương tác với môi trường làm biên độ sóng và pha thay đổi theo cách phụ thuộc vào tính chất của môi trường. Những thay đổi về biên độ (độ sáng) phát sinh từ sự tán xạ và hấp thụ ánh sáng, thường phụ thuộc vào bước sóng và có thể làm tăng màu sắc. Thiết bị chụp ảnh và mắt người chỉ nhạy cảm với các biến thể biên độ. Nếu không có sự sắp xếp đặc biệt, các thay đổi pha sẽ vô hình. Do đó, thay đổi pha thường mang thông tin quan trọng. Kính hiển vi phản pha yêu cầu loại vật kính đặc biệt được thiết kế đặc biệt (thường kí hiệu là Ph1, Ph2, Ph3), đồng thời tụ quang cũng cần có vòng phase tương ứng với vật kính đang dùng.

Kỹ thuật phân cực

Kính hiển vi phân cực là một kỹ thuật tăng độ tương phản cho các mẫu có tính chất lưỡng chiết (hay tính chất bất đẳng hướng) như tinh thể, khoáng vật, sơi cơ,…. Kính hiển vi phân cực có độ nhạy cao và có thể sử dụng cho cả công việc định tính và định lượng.  Kỹ thuật hiển vi phân cực thường ứng dụng trong ngành nghiên cứu địa chất và khoa học vật liệu để xác định các khoáng chất dựa trên đặc tính khúc xạ và mầu sắc. Trong ngành sinh học, kính hiển vi phân cực thường được dùng để xác định hoặc chụp ảnh các cấu trúc khúc xạ kép như tinh thể hoặc quan sát Xenluloza trên thành tế bào thực vật hay các hạt tinh bột.
 

Kính hiển vi quang học thông thường yêu cầu có thêm ít nhất hai bộ phận để có thể thực hiện được kỹ thuật tương phản phân cực. Để phát hiện được khúc xạ kép thì cần sử dụng nguồn sáng phân cực tuyến tính. Do đó, hai bộ lọc phân cực được lắp thêm vào trục quang của kính. Bộ lọc phân cực thứ nhất có chức năng tạo ra ánh sáng phân cực để chiếu xuống mẫu và bộ lọc phân cực thứ hai được gọi là bộ phân tích, có chức năng giới hạn ánh sáng thu được trở thành ánh sáng khúc xạ. Các bộ lọc phân cực phải được thiết kế vuông góc 90° với nhau để đặt được vị trí được gọi là “vị trí tối”. Khi các bộ lọc phân cực được xác lập ở vị trí này, không có ánh sáng đi qua máy ảnh hoặc thị kính và hình ảnh mẫu vật bị tối đen. Thiết lập vị trí tối là bước quan trọng trong hiển vi ánh sáng phân cực vì yếu tố này đảm bảo chỉ có ánh sáng có biến đổi về mặt phẳng phân cực với mẫu mới có thể quan sát được.

Khi ánh sáng đi qua bộ phân cực thứ nhất thì ánh sáng phân cực tuyến tính sẽ được tạo ra. Nếu ánh sáng phân cực tuyến tính đi qua một vật liệu khúc xạ kép trên mặt phẳng phân cực có vị trí phù hợp thì ánh sáng đó được khúc xạ và chia thành hai chùm sáng chị em, và mặt phẳng phân cực của một phần chùm sáng được xoay tới góc 90°. Chùm sáng khúc xạ sau đó đi qua bộ phân cực thứ hai (bộ phân tích), nếu được điều chỉnh ở vị trí phù hợp (có góc 90° so với bộ lọc phân cực thứ nhất). Do đó, chỉ những vật liệu khúc xạ kép mới tạo ra ảnh trong kính hiển vi phân cực.

Kỹ thuật DIC

Kỹ thuật DIC (Differential interference contrast) , hay kỹ thuật Nomarsk. Kỹ thuật này được phát triển bởi nhà vật lý người Ba Lan Georges Nomarski vào năm 1952. Kỹ thuật DIC được dùng để tăng cường độ tương phản cho mẫu sống và mẫu không nhuộm, tạo hình ảnh giả 3D. DIC hoạt động theo nguyên lý  giao thoa để thu được thông tin về chiều dài đường quang của mẫu, để xem các tính năng vô hình khác. Một hệ thống quang học tương đối phức tạp tạo ra một hình ảnh với đối tượng xuất hiện màu đen sang màu trắng trên nền xám. Hình ảnh này tương tự như hình ảnh thu được bằng kính hiển vi tương phản pha nhưng không có quầng nhiễu xạ sáng. Đường đi của ánh sáng trong kính hiển vi DIC gần giống như kính hiển vi phân cực nhưng có thêm hai lăng kính lưỡng chiết DIC được chèn vào đường quang, một được đặt ở tụ quang và một ở gần vật kính. DIC được ứng dụng trong Sinh học để quan sát các mẫu sống và mẫu không nhuộm để tạo hình ảnh giả 3D. Ngoài ra, DIC còn được ứng dụng trong ngành bán dẫn. 

Lan Phương (Theo Zeiss.com)