Chuẩn hóa kính hiển vi trước khi sử dụng (Điều chỉnh kính để có Độ rọi - Köhler Illumination chuẩn!)

Độ rọi mẫu là điều quan trọng nhất để thu được các hình ảnh chất lượng cao trong kính hiển vi. Độ rọi Köhler lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 1893 bởi August Köhler của tập đoàn Carl Zeiss, đây là một phương pháp tạo ra một độ rọi mẫu tối ưu. Các nhà sản xuất đã thiết kế ra các kính hiển vi hiện đại với các thấu kính hội tụ và các thành phần quang học khác nhau để tạo ra một độ phóng đại và sự tập trung hình ảnh của các đèn filament lên mặt phẳng màng chắn sáng của một tụ quang cố định. Sự đóng hoặc mở màng chắn sáng kiểm soát góc của các tia sáng đi ra từ tụ quang và đi tới mẫu từ mọi phía. Cài đặt góc mở của tụ quang, cùng với khẩu độ của vật kính xác định khẩu độ số của hệ kính hiển vi. Khi màng chắn sáng mở, khẩu độ số làm việc của kính hiển vi tăng lên, cho kết quả là năng suất phân giải cao hơn và ánh sáng truyền qua. Các tia sáng song song đi qua và chiếu lên mẫu vật sẽ hội tụ tại mặt phẳng tiêu cự sau của vật kính.

Cấu hình thích hợp của một kính hiển vi liên quan tới độ rọi là một trong những khái niệm dễ hiểu lầm nhất trong kính hiển vi quang học, và là một chỉ số quyết định phải được đáp ứng để đạt được sự hoạt động tối ưu. Cường độ và phổ bước song của ánh sáng phát xạ bởi nguồn sáng là quan trọng nhất, nhưng điều bắt buộc hơn đó là ánh sáng phát xạ từ các điểm khác nhau trên đèn sợi đốt phải được thu thập và hội tụ tại mặt phẳng màng khẩu độ của tụ quang. Trường liên hợp và các mặt khẩu độ là cần thiết để tạo ra đội rọi thích hợp trong kính hiển vi được chỉ ra trong hình 1. Trong mục này, hướng dẫn mô tả để tạo ra độ rọi Kohler (sử dụng trong kính hiển vi phản xạ và truyền qua). Sự tạo ảnh và quan sát thành công sẽ xảy ra khi quy trình này được thực hiện chính xác.

Bước đầu tiên cần phải chuẩn bị kính hiển vi có độ rọi Kohler liên quan tới các quy trình cơ bản để quan sát một mẫu dưới điều kiện trường sáng. Đầu tiên, nếu các thấu kính có các vòng tròn có pha khác nhau, các lăng kính tương phản giao thoa vi sai, hoặc các màng hoặc phim lọc khác, xoay mâm tới khẩu độ trường sáng, những thứ không chứa màng lọc hay lăng kính. Thứ 2, lựa chọn mẫu phù hợp. Các mẫu thích hợp nhất bao gồm các mẫu trường sang nhuộm màu. Ví dụ như các mô động vật hoặc thực vật rất mỏng (bằng hoặc nhỏ hơn 8um).

Các bước để tạo ra độ rọi Kohler
• Bật nguồn sáng lên và giữ một mẩu giấy nhỏ ngay phía trên các thấu kính hội tụ như hình 2a. Mục đích là để kiểm tra xem nguồn sáng có hoạt động và chiếu sang vào kính hiển vi không. Trong trường hợp không quan sát thấy ánh sáng thì kiểm tra các dây dẫn, đèn, và nguồn điện để đảm nảo các yếu tố này không có trục trặc gì. Hoặc không, thay đổi đèn khác. Khi kính hiển vi hoạt động bình thường,1 điểm sang như hình 2a sẽ nhìn thấy trên giấy.

• Tiếp theo, mở màng chắn sáng tới vị trí rộng nhất (mở hết cỡ). Điểm sáng chiếu vào tấm giấy như hình 2b sẽ có đường kính tối đa.

• Bước tiếp theo đó là di chuyển tấm giấy và đặt nó vào giữa mẫu và vật kính như hình 3a và dung vật kính có khẩu độ số lớn nhất. Khi màng chắn sáng thấu kính mở ra từ từ, cường độ ánh sáng chiếu lên tấm giấy sẽ tăng lên, đạt được độ sáng tối đa ở mức mở lớn nhất. Khi sử dụng một thấu kính hội tụ có khẩu độ số thấp với các bộ lọc sắc, thì cần loại bỏ bộ lọc sắc khỏi đường truyền sáng trước khi thực hiện.

• Chiều cao của tụ quang có thể được điều chỉnh sử dụng các núm để dịch chuyển các thành phần này lên hoặc xuống dọc theo trục quang học của kính hiển vi như hình 3b. Điều chỉnh độ cao của tụ quang sao cho các thấu kính phía trên là nằm xấp xỉ từ 1 – 3mm ở dưới bề mặt của lam chứa mẫu. Chắc chắn các thấu kính ở trên của tụ quang không chạm vào lam kính. Các kính hiển vi hiện đại thường được trang bị một chốt chặn cho phép chặn vị trí cao nhất của tụ quang để tụ quang cố định ở một độ cao xác định mà không chạm vào lam kính.

• Ánh sáng có thể nhìn rõ trong thị kính như hình 4a. nếu ánh sáng quá sáng, giảm bớt cường độ cho đến khi bạn tìm thấy mức phù hợp. Sau đó, cài đặt thị kính sao cho có thể quan sát thấy một vòng tròn đơn.
• Nhìn vào bên trong kính hiển vi và di chuyển cẩn thận giá đỡ mẫu và mẫu lên và xuống cho tới khi nhìn rõ hình ảnh sắc nét nhất có thể như hình 4b. Tại điểm này, có thể có các điểm sáng hoặc tối hoặc màng chắn làm mờ trường quan sát, khi đó việc tạo độ rọi vẫn chưa hoàn thành.

• Bây giờ thì các thành phần cơ bản của kính hiển vi đã được cài đặt, thiết bị đã sẵn sáng để thiết lập độ rọi Kohler. Đầu tiên là thu hẹp kích thước của màng chắn sáng và dịch chuyển tụ quang lên và xuống thong qua núm điều chỉnh cho tới khi nhìn thấy 1 hình ảnh sắc nét viền của màng chắn sáng để lại như hình 5a. Nếu chưa được thì tiếp tục thay đổi kích thước của màng chắn sáng và thử lại.
• Ở vị trí này, màng chắn sáng hội tụ rõ rang, nhưng tụ quang chưa vào tâm. Các núm trung tâm trên tụ quang của kính hiển vi nâng khung lên sẽ được sử dụng để điều chỉnh tụ quang vào tâm. Như hình 5b. Đóng màn chắn sáng tới vị trí nhỏ nhất và sử dụng vít trung tâm để đặt lại độ mở ánh sáng vào tâm của trường sáng. Khi tụ quang vào tâm, mở màn chắn sáng cho tới khi nó nhìn rõ hoàn toàn.

Ở bước này, bạn đã có một hình ảnh phù hợp trong trường quan sát. Các bước còn lại là để tối ưu độ tương phản. Nhớ rằng, đầu tiên bạn mở màng chắn sáng của tụ quang để có nhiều ánh sáng hơn. Kích thước của khẩu độ phải chính xác để cải tiến độ tương phản và để đạt được sự cân bằng phù hợp giữa độ phóng đại và độ phân giải. Nhớ rằng việc đóng khẩu độ của tụ quang lại quá nhiều sẽ dẫn tới sự giảm của độ phân giải và và hình ảnh sẽ tối đi đáng kể.
Bạn có thể quan sát trực tiếp màng chắn khẩu độ khi bỏ thị kính ra như hình 6a. mắt nên để cách ống từ 10 – 20 cm để quan sát tốt nhất. Khi nhìn xuống ống quan sát thì mở và đóng màng chắn khẩu độ tụ quang tới khi nhìn thấy rõ hình ảnh trong màn chứa ảnh của vật kính. Cuối cùng, cài đặt đường kính của màng chắn sáng sao cho độ rọi nằm giữa khoảng 65 – 80 % đường kính của đồng tử như hình 6b, tạo ra độ phân giải gần như tối đa và tương phản tôi sưu nhất. Sau khi điều chỉnh xong thì lắp thị kính vào.
Kính hiển vi đã được thiết lập hoàn chỉnh để quan sát mẫu theo độ rọi Kohler, nhưng chỉ đối với vật kính cái được sử dụng cho thiết bị này. Đối với vật kinh khác ta phải điều chỉnh liên tục khẩu độ của tụ quang và màng chắn cho độ rọi tối ưu . Việc loại bỏ thị kính là cần thiết mỗi khi dùng vật kính mới. Khi kích thước màng chắn khẩu độ được cài đặt cho vật kính 10x, nó thường đáp ứng kích thước cho các vật kính khác với việc quan sát hình ảnh. Đầu tiên mở khẩu độ chạm đến điểm dừng, sau đó đóng nó từ từ tới khi hình ảnh trở nên tối hơn và sự tương phản tăng đáng kể.