PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA SỰ THUỶ PHÂN PROTEIN TINH KHIẾT VỚI GIẢI PHÁP PHÂN TÍCH UPLC AMINO ACID

GIỚI THIỆU
Phân tích amino acid được sử dụng trong phòng thí nghiệm nghiên cứu cấu trúc protein để cung cấp 2 loại thông tin. Đầu tiên, tổng số lượng amino acids là đơn vị đo trực tiếp lượng protein trong mẫu. Thứ 2, đo tỷ lệ các amino acid cung cấp thông tin để xác nhận danh tính của protein và phát hiện các dẫn xuất. Cả hai ứng dụng đều yêu câu mạnh mẽ, chính xác và cac phép đo độ nhạy và định lượng các amino acid. Ngày càng có nhiều nhu cầu về các phòng thí nghiệm này để cung cấp những kết quả nhanh hơn, chính xác và tiết kiệm hơn. 

Ứng dụng phân tích axit amin Waters UPLC ® là giải pháp chìa khóa để giải quyết các nhu cầu này. Giải pháp tổng thể hệ thống này bao gồm một dẫn xuất mẫu được thiết lập và hiểu rõ kit dẫn xuất mẫu, chất rửa giải, cột sắc ky và hệ thống sắc ký ACQUITY UPLC ®, đầu dò UV, phần mềm Empower ™. 
 
Trong thí nghiệm này, giải pháp hệ thống  được sử dụng để đo thành phần và nống độ của một loại protein đã biết. Sự chính xác của phép định lượng được so sanh vơi các kết quả đã biết chính xác
 
THỰC NGHIỆM
Mẫu
Các mẫu albumin huyết thanh từ bò thủy phân bằng axit (BSA) được chuẩn bị trong một phòng thí nghiệm độc lập. Các mẫu được cũng cấp với nồng độ khoảng 1,0 mg/mL trong 0,1 M HCl được làm kín dưới khí argon, bảo quản ở -80°C  cho đến khi phân tích. 
Mẫu dẫn xuất:
Mẫu được pha loãng 1:10 bằng 0,1 M HCl trước khi tạo dẫn xuất. Phương thức tạo dẫn xuất tiêu chuẩn bao gồm trung hoà lượng acid dư bằng 0,1 M NaOH. Các điều kiện để tạo dẫn xuât và phân tích được mô tả chi tiết trong hướng dẫn Hệ thống Ứng dụng Phân tích Waters UPLC Amino acid (P/N 71500129702).
• 10 μL mẫu được pha loãng 1:10 với 0,1 M HCl
• 10 μL 0,1 N NaOH
• 60 μL AccQ • Tag ™ Ultra Borate Buffer
• 20 μL AccQ • Tag Ultra Reagent

Điều kiện LC
Hệ thống LC: Hệ thống ACQUITY UPLC 
Detector: TUV ơt 260
Cột:  AccQ • Tag Ultra 2.1 x 100 mm, 1.7 µm
        Code: 186003837
Nhiệt độ cột:  55 ° C
Lưu lượng dòng chảy: 700 µL / phút
Pha động A: 1:20 Pha loãng AccQ • Tag Ultra Eluent A
                  Code : 186003838
Pha động B:  AccQ • Tag Ultra Eluent B
        Code 186003839
Chương trình gradient:   AccQ • Tag Ultra Hydrolysate Method
Thể tích tiêm:   1 μL

                               Hình 2. Phân tích tiêu chuẩn thủy phân axit amin, 10 pmoles mỗi trên cột
KẾT LUẬN
Hình 2 cho thấy sắc ký đồ của một chất chuẩn có chứa Acid amin thường được tìm thây trong các mẫu thuỷ phân protein. Mỗi acid amin khoảng 10pmoles trên cột. Đối với các phân tích định lượng, hiệu chuẩn bở ba điểm 0,5; 10; và 25 pmoles.

Việc phân tích một chất thuỷ phân BSA điển hình được thể hiện trong Hình 3. Nồng độ ban đầu ước tính phù hợp với sắc ký đồ đại diên cho tổng ố 9ng protein trên cột. Chất phân tích này được lặp lại tổng cộng 75 lần, trong hơn 5 ngày làm việc với 2 cột và 5 loại pha động khác nhau. 75 lân tiêm đại diện cho 5 độ pha loãng hoàn toàn độc lập, mỗi độ pha loãng dược tạo dẫn xuất 5 lần, mỗi dẫn xuất mẫu được tiêm trong 3 lần. 
 
Thành phần axit amin, được biểu thị bằng lượng dư / mol của protein, được so sánh với chuỗi giá trị đã biết trước. Bảng 1 cho thấy giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của mỗi acid amin trên tất cả 75 lần tiêm phân tích, Tryptophan và Cysteine/Cystine bị loại trừ khỏi phép tính vì chúng bị phá huỷ bởi quá trình thuỷ phân bằng acid. Thành phần mol các hợp chất được đo phù hợp với giá trị mong đợi. Độ tin cậy của UPLC Amino Acid Analysis Application được xác nhận bởi khả năng lặp lại các kết quả  trên một số lượng lớn của các định lượng bao gồm sự thay đổi có thể phát sinh từ nhiều cột, chât rửa gỉai và các dẫn xuất.

                    Hình 3. Phân tích mẫu thủy phân BSA, Khoảng 9 ng trên cột

Bảng 1. So sánh thành phần quan sát được với thành phần dự kiến ​​bắt nguồn từ trình tự đã biết của BSA

* Trung bình của 75 điểm dữ liệu (25 điểm dẫn xuất, mỗi điểm được đưa vào trong ba lần; giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn)

Bảng 2. Độ lặp lại của phương pháp tính lượng protein BSA trong mẫu
Dữ liệu phân tích được sử dụng để tính toán lượng  protein trong mẫu. Số lượng của mỗi axit amin được biểu thị bằng khối lượng phân tử cặn. Tổng khối lượng của acid amin bằng khối lượng của protein. Bằng 2 tổng hợp kết quả định lượng của 75 phép xác định với giá trị trung bình cho 3 lần tiêm cho mỗi dẫn xuất. Đo lường lượng tổng tương ứng với 0,7mg/mL trong nguyên liệu ban đầu. các lượng ước tính được sử dụng để điều chế dịch thuỷ phân chưa được xác minh độc lập. Cần lưu ý thêm  rằng, điêu này đo lượng protein không bao gồm cysteine/cystine và trytophan, vì chúng hầu như bị phá huỷ bằng việc thuỷ phân protein.

Độ lặp lại của phép xác định 75 chất phân tich cho RSD 7%. Kiểm tra chi tiết cho thấy rằng, phần lớn các phương ai này là do sự khác biệt của thử nghiệm 5 so với bốn thử nghiệm còn lại. Vì tất cả các lần lặp lại trong thử nghiệm 5 đều thâp hơn những lần khác, phương sai này phù hợp với sự khác biệt trong pipet trong quá trình chuẩn bị mẫu ban đầu. Việc bổ sung một chất nội chuẩn đối với mẫu được thuỷ phân sẽ cải thiện được độ tin cậy của kết quả phân tích cuối cùng. Norvaline là chất chuẩn nội dùng cho mục đích này.
KẾT LUẬN
Cấu trúc protein và các phòng thí nghiệm dược phẩm sinh học dựa vào định lượng chính xác các acid amin để xác nhận danh tính và tổng lượng protein trong mẫu của chúng, Các phân tích hiển thị ở đây chứng minh rằng Waters UPLC Amino Acid Analysis Application có thể đảm bảo kết quả cho các phòng thí nghiệm này.

Tỷ lệ mol của các axit amin có thể lặp lại qua nhiều lần dẫn xuất và lặp lại thuốc tiêm. Thành phần được đo lặp lại trùng với dự kiến trình tự BSA

Định lượng protein tuyệt đối trong các mẫu được xác định bằng tổng khối lượng dư của các acid amin.  Độ lặp lại của các phép đo này là ± 7%. Các đóng góp lớn nhất vào phương sai này là  độ pha loãng mẫu ban đầu. Việc kết hợp chât nội chuân trong quá trình thuỷ phân sẽ cải thiện độ chính xác của phép xác định (Norvaline được khuyến nghị là một tiêu chuẩn nội bộ cho phương pháp). 

Waters UPLC Amino Acid Analysis Application cung cấp một phương pháp then chốt hoàn chỉnh để phân tích mẫu thuỷ phân protein.  Hệ thống ACQUITY UPLC cho  độ phân giải cao để xác định peak nhất định và dễ dàng tích hợp. Với đầu dò UV chuẩn, tất cả các dẫn xuất axit amin có hệ số tắt tương ứng để tạo điều kiện phân tích định lượng. Mức độ nhạy tương ứng với hàm lượng nanogram protein . Tính chắc chắn của hệ thống lá giải pháp đảm bảo nhận dang nhanh chóng và rõ ràng các protein. Cột được kiểm tra trươc, rửa giải và thuốc thử đảm bảo rằng người sử dụng sẽ không mất thời gian điều chỉnh lại phương pháp. Tổng lượng mẫu đòi hỏi ít để phân tich tốt góp phần làm tăng tuổi thọ cột và giảm thiểu nguy cơ thất bại trong nhiều lần chạy. Độ phân giải cao đảm bảo độ tin cậy của xác định đỉnh và định lượng để chạy mà không cần lặp đi lặp lại. Các phương pháp và các báo cáo được xác định trước giúp đơn giản hoá việc báo cáo kết quả. Những lợi ích phân tich này thu được trong thời gian phân tích ngắn cho thông lượng cao, cần thiết cho quy trình xác định thành phần và nồng độ protein.