Phân tích methotrexate trong huyết tương và huyết thanh

1. Giới thiệu.

Trong bài trước, chúng ta đã được biết đến phương pháp phân tích nồng độ Busulfan, một loại thuốc alkyl hóa, có tác dụng ngăn cản sự sao chép DNA và phiên mã RNA, thường dùng để điều trị bệnh bạch cầu tủy xương mãn tĩnh. Hôm nay, chúng ta sẽ tiếp tục tiemf hiểu một ứng dụng mới trong nghiên cứu lâm sàng đó là phân tích và kiểm soát nồng dộ Methotrexate trong huyết tương và huyết thanh người bệnh.

Methotrexate thuộc nhóm antifolates được sử dụng rộng rãi như là một loại thuốc chống ung thư. Một số phương pháp truyền thồng để xác định nồng độ của thuốc này là phương pháp miễn dịch phân cực huỳnh quang(immunofluorescence assays) và phương pháp enzym. Tuy nhiên, chúng ta biết rằng các phương pháp này bị ảnh hưởng bởi phản ứng chéo với chất chuyển hóa 2,4-Diamino-N10-methylpteroic acid(DAMPA), khi sử dụng methotrexate với liều cao(>500 mg/m2) cho các bênh nhân có lymphoma CNS( U lympho hệ thần kinh trung ương-Central Nervous system Lymphoma) thường sẽ đi kèm với việc sử dụng Glucarpidase (Voraxaze) hoặc Leucovorin để làm giảm nồng độ methotrexate xuống dưới 1 mmol/L. Với phương pháp iễn dịch có thể sẽ cho kết quả cao hơn so với thực tế sau khi dùng glucarpidase do việc tăng nồng độ DAMPA, vì vậy, một phương pháp có độ chọn lọc cao là cần thiết để phân tích methotrexate ở nồng độ cao.

Chúng tôi mô tả một phương pháp phân tích sử dụng nội chuẩn ethotrexate-²H₃. Sử dụng công nghệ khối phổ hai lần tứ cực  ( LC/MSMS) trên hệ thống máy ACQUITY UPLC I-Class  và Xevo TQD Mass Spectrometer của hãng Waters.

2. Mô tả phương pháp
   1. Dãy đường chuẩn và QC

Đường chuẩn được dựng với dãy nồng độ sau: 0.025–10 µmol/L

Các điểm QC bao gồm: 0.1, 2.5, 10, và 75 µmol/L

1. 2. Chiết mẫu:

Lấy 50ul mẫu, 250 ul của nội chuẩn nồng độ 0.1umol/l, lắc, vortex trong 30 giây, ly tâm 2 phút, 16000 vòng/phút. Chuyển 50ul phần nổi vào vial, thêm 950 ul nước để đem vào máy UPLC-MS/MS

2.3 Điều kiện chạy máy

Các điều kiện chạy máy được mô tả trpng bảng 1

Bảng 1: Các thông số chạy máy

3. Kết quả và thảo luận

Với điều kiện chạy ở mục 2, methotrexate đã được phân tách từ chất chuyển hóa 7-hydrocymethotrexate và DAMPA. Hình 2 cho thấy nồng độ thấp của calibrator và chất chuyển hóa, không có sự nhiễm chéo hệ thống nào được quan sát thấy với nồng độ methotrexate lên tới 100 umol/L

Độ lặp lại  và chính xác của hệ thống được thể hiện trong bảng 2

Ảnh 2: Sắc ký đồ của methotrexate (0.025 ul/L), 7-hydroxymethotrexate (5umol/L) và DAMPA (5 µmol/L) trong huyết tương

(Thanglong Instruments)